微生物方法学验证培训.doc

微生物方法学验证培训 包括： 1.细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证 ------------准确性（回收率） 2.控制菌检查法的验证--------------专属性 3.实例讲解 1细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证 1.验证的目的： 确认所采用的方法适合该药品的细菌、霉菌及酵母菌数的测定。照此检测法和检验条件进行供试品细菌、霉菌及酵母菌数检查，能保证结果的准确、可靠。 2.验证的步骤： 根据样品的特性，制定检验方法和检验条件 保证验证试验所采用的仪器、试剂、培养基均符合要求 按制定的方法进行试验 根据结果判断是否符合验证标准 验证时，按供试液的制备和细菌、霉菌及酵母菌计数所规定的方法及要求进行。验证试验至少进行3次独立平行试验，并分别计算各试验菌每次试验的回收率。 3.验证用菌珠： 细菌计数验证用大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌 霉菌及酵母菌计数验证用白色念珠菌、黑曲霉 加菌量50~100CFU 4.验证方法的选择：平皿法（包括稀释法）、薄膜过滤法、中和法、离心沉淀法、联合方法 5.样品稀释级的选择：最低稀释级1g或1ml 6.培养基：营养琼脂、玫瑰红纳琼脂、改良马丁培养基、营养肉汤培养基、改良马丁琼脂培养基 7.菌液制备： 接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至10ml营养肉汤中，30~35℃18~24h，取此培养物1ml加0.9%无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10-5~10-7，使菌数约为50~100CFU/ml。 接种白色念珠菌的新鲜培养物至10ml改良马丁培养基中，23~28℃24~48h，取此培养物1ml加0.9%无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10-5~10-7，使菌数约为50~100CFU/ml。 接种黑曲霉的新鲜培养物，至改良马丁琼脂斜面上， 23~28℃5~7天，加3~5ml0.9%无菌氯化钠溶液洗下霉菌孢子，吸出菌液，取1ml菌液加0.9%无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10-4~10-6，使菌数约为50~100CFU/ml。 8.供试品的处理： 固体10g供试品+稀释剂至100ml 液体10ml供试品+稀释剂至100ml 分为菌液组、供试品对照组、试验组、稀释剂对照组 菌液计数方法 十倍稀释法，具体稀释到何种级别，需要通过平皿计数后，才可确定。 实际操作中，第一步，10-1 的级别，从菌原液中，吸1 ml到9ml生理盐水中，有的是吸0.1ml到9.9ml生理盐水中，视菌浓度而确定。 实际操作中，十倍递增稀释法，操作繁琐，用到的试管及多，费时，下面讲述两管法进行菌液的计数。操作简便，省时省力。 两管法只是我们的经验方法，不能作为书面记录中的方法记载，记录中仍写的是十倍递增稀释法。 而黑曲霉我们不用两管法，后面有讲述。 两管法中，生理盐水的量也是视浓度而定，有的是5ml，有的是10ml，根据平皿计数后的结果，做相应的调整。 两管法中，吸取0.1ml至已经倒好培养基的平皿中，转匀，再用接种针均匀涂开。如果平皿上长8CFU的菌，那么菌浓度为80CFU/ml。 做验证之前，头天先必须摸索出菌液的浓度，点计菌数之后，就可以制出50~100CFU的菌悬液，同时做验证试验。 黑曲霉计数：取孢子悬液，套一环至100ml含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，再吸取0.1ml至平皿中，涂布，计数。 上面的含黑曲霉的100ml无菌氯化钠溶液，可以作为储备液，于2~8℃冰箱中，可以保存几个月，稳定，且不会担心孢子散出。 8.1菌液组：测定所加的试验菌数 平皿法：取试验用的1ml菌液（约50~100CFU），分别注入平皿中，立即倾注琼脂培养基，平行2个，测定其菌数。 8.2供试品对照组：取规定量供试液，按菌落计数方法测定供试品本底菌数。 8.3试验组： 平皿法：取可能用的最低稀释级供试液1ml和50~100CFU试验菌，分别注入平皿中，立即倾注琼脂培养基，平行2个，测定其菌数。 培养基稀释法（平皿法）：取可能用的最低稀释级供试液1ml，分别注入n个平皿，每个平皿再注入50~100CFU试验菌，平行2个，测定其菌数。 如:分摊到5个平皿，那么每个平皿就注入0.2ml+1ml菌液，每份平行2个平皿，共10个平皿。计算0.2ml供试液，平均菌数。 同样，供试品对照组也是 同法操作，不加菌液。 薄膜过滤法：取可能用的最低稀释级供试液，过滤，冲洗，应在最后一次的冲洗液 中加入50~100CFU试验菌，过滤，按薄膜过滤法，测定其菌数，至少要一张膜。 离心沉淀法：取可能用的最低稀释级供试液，5