13-2三羧酸循环.ppt

* ? 丙酮酸脱氢酶复合体 丙酮酸脱氢酶复合体包括丙酮酸脱羧酶(pyruvate decarboxylase)（E1），二氢硫辛酸乙酰转移酶(dihydrolipoic acid transacetylase)（E2）和二氢硫辛酸脱氢酶(dihydrolipoic acid dehydrogenase)（E3）三种不同的酶。 dihydrolipoyl transacetylase(E2) dihydrolipoyl dehydrogenase(E3) 丙酮酸脱氢酶的作用方式： 1．丙酮酸脱羧形成羟乙基-TPP 丙酮酸与丙酮酸脱羧酶(E1)上的TPP连接，TPP的噻唑环中氮和硫原子之间的碳原子的氢比大多数有=CH-基的氢更容易解离，使该碳原子形成反应性很强的负碳离子，因而可亲核攻击丙酮酸的羰基碳原子形成加成物。TPP的噻唑环上的N带有正电，可作为电子穴，使脱羧作用容易进行，脱羧后形成一个烯醇中间物，加氢后产生羟乙基TPP。 2．由二氢硫辛酸乙酰转移酶（E2）催化使羟乙基被氧化成乙酰基，同时转移给硫辛酸与酶蛋白的赖氨酰ε氨基所形成的硫辛酰胺上，形成乙酰硫辛酰胺。 3．二氢硫辛酸乙酰转移酶（E2）还催化乙酰硫辛酰胺上的乙酰基转移给CoA形成乙酰CoA。 4．二氢硫辛酸脱氢酶（E3）使被还原的硫辛酰氨重新氧化，并将氢传递给它的辅基FAD。 5．FADH2再使NAD+还原，形成的NADH可进入呼吸链氧化并产生ATP。 FADH2-E3 + NAD+ → FAD-E3 + NADH + H+ 丙酮酸脱氢酶复合体作用模式 羧 2 3 3 二氢硫辛酸乙酰转移酶 二氢硫辛酸脱氢酶 + + 硫辛酰氨摇摆臂及其在丙 酮酸脱氢酶复合体中的作用 硫辛酰胺摇摆臂作用的主要步骤： A)硫辛酰胺与酶1结合的羟乙基TPP相互作用； B)在酶2上与辅酶A-SH作用产生乙酰辅酶A; C)与酶3的FAD作用产生二硫化合物。 8碳硫辛酸与酶2活性中心的6碳赖氨酸残基形成一个长度为14埃的柔性链。 酶1上的TPP与酶3上的FAD相距约55埃；酶2上的单个硫辛酰胺臂的摆动不够连接酶1与酶3。这个问题的解决办法是酶2上至少有两个硫辛酰胺臂，每个长度为14埃的臂摆动时可覆盖28埃的距离，两个硫辛酰胺臂就可连接相距56埃的两个功能基团。 第一条硫辛酰胺臂接受了酶1的二碳片段，然后以乙酰基形式转移到第二条臂，再直接转移到辅酶A上。 带有两个巯基的还原的硫辛酰胺再由酶3氧化，酶3的FAD还原成FADH2。 这些酶（E1,E2和E3)物理上的并列可以保证反应没有不需要的副反应，不使中间物从催化位点扩散，使反应能顺利进行。 丙酮酸脱氢酶复合体是细胞通过催化连续反应的酶的并列来最经济的实现其功能的例子之一。 大肠杆菌中丙酮酸脱氢酶的分子量为4600000，是由60条多肽链组成的多面体，直径约30nm，在电镜下可观察到复合体的存在。 二氢硫辛酸乙酰转移酶位于中心，有24条肽链。丙酮酸脱羧酶也有24条肽链，二氢硫辛酸脱氢酶由12条肽链组成。 E.coli丙酮酸脱氢酶复合体电镜照片 ? 三羧酸循环的途径 三羧酸循环共有八步反应。 反应1： 二个碳原子以乙酰辅酶A形式进入循环 乙酰CoA与草酰乙酸缩合形成柠檬酸。 由柠檬酸合成酶催化的起始反应是一个类似于醛醇缩合的反应。 CH3 + 柠檬酸合成酶反应机制 乙酰辅酶A上活化的乙酰基的甲基碳在柠檬酸合成酶的作用下丢失一个质子，所产生的负碳离子对草酰乙酸的羰基碳进行亲核攻击。 这导致缩合产生高度不稳定的柠檬酰辅酶A，可自发水解产生柠檬酸。这个反应是高度放能的，是整个反应的调节位点。 柠檬酰辅酶A 负碳离子 + B是酶分子中的一个碱性氨基酸残基 哺乳类动物中柠檬酸合成酶由2个49000亚基组成。X-晶体衍射研究表明此酶催化反应时与底物结合会产生很大的构象变化。 在没有底物时，这个酶的结晶是处于“打开”型，在二聚体蛋白两个催化域之间有大裂缝。 与底物或CoA-SH的结合使酶处于“关闭”构象，裂缝基本上没有了。 猪心柠檬酸合成酶三维结构 (a) “open” conformation (b) “close” conformation 柠檬酸合成酶反应机制的补充： 柠檬酸合成酶上有两个组氨酸残基起作用。其中一个与草酰乙酸羰基氧原子作用使其易受攻击，另一个组氨酸残基接受乙酰CoA的甲基碳上的质子。 形成的柠檬酰CoA使酶结构进一步变化，使活性位置中增加一个天门冬氨酸残基，它可以捕获水分子以水解硫酯键。 水解后CoA和柠檬酸相继离开酶，酶恢复成开放型。这样合成酶不会因水解乙酰CoA而造成浪费。因为只有酶与草酰乙酸结合后，才能与乙酰CoA结合，而且会引起硫酯键水解的天门冬氨酸残基，只有在形成柠檬酰Co