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环介导等温扩增的评价用来快速检测丛枝菌根真菌 食品科学与工程学院 生物工程081 杨娟 2084308111 在2007年7月5日，2007年8月10日收到2007年8月28日2007年9月21日 对丛枝菌根真菌的检测和量化是对任何与共生菌相关的工作都是重要的。在这里，我们应用环介导扩增（LAMP），等温DNA扩增技术，在体外条件下培养丛枝菌根真菌（AMF）。环介导扩增技术第一次应用在丛枝菌根真菌，我们引用环介导扩增的底物，它能够扩大从胡萝卜的根部移植来的丛枝菌根真菌DNA，和几个类群的丛枝菌根真菌提取的基因组DNA（低至模板为10-2纳克）。这项研究是再更具挑战性的环境条件下进行检测这种方法的新起点。 2007年爱思唯尔有限公司保留所有权利。关键词：环介导扩增（LAMP），丛枝菌根;血管球;检测;根定植经常使用的技术大多是基于对真菌的代谢物或在根部的真菌结构的微观评估的量化Glomus intraradices (DAOM 181602),G. intraradices (MUCL 43194), Glomus proliferum(MUCL 41827), Glomus lamellosum (MUCL 43195),Glomus celebriforme (MUCL 43208) and Gigaspora roseaNicolson and Schenck (DAOM 194757)的培养与胡萝卜毛状根的衍生的Ri T—DNA有关（Gadkar ang Rillig,2005）。 丛枝菌根真菌孢子通过凝胶剂的消融在分裂板上获得（Phytagel），使用10毫摩尔，PH为6的柠檬酸盐缓冲液就可以被发现（1991）。从胡萝卜的根部移植双重培养的G. intraradices，有着不同的年龄和移植率也被使用。根染色（菲利普斯和海曼，1970）和被移植的根的比生长速率也被测定（纽曼，1966）。 我们选择的G. intraradices?-微管蛋白基因（GenBank accession no.BE603903）去设计环介导等温扩增DNA的引物。引物的序列也通过引物探测V4软件程序深度分析（http://primerexplorer.jp/e/index.html）然后设计环介导等温扩增DNA的引物：AMB-F3（前内引物）、AMB-B3（后内引物）、 AMB-FIP（前外引物）、AMB-BIP（后外引物）。此外，那个能够识别目标DNA模板链和反义链的每一个内部引物与T盒结合。引物定制合成。 从G. intraradices单独的孢子分离得到的染色体组的DNA和前面描述的很像。同样用Qiagen公司DNeasy试剂盒从胡萝卜根部提取的染色体组的DNA，移植并且控制。染色体组的DNA悬浮在缓冲液中。 环介导等温扩增DNA扩大培养反应最后反应混合物体积25微升中包含了各1.6微摩尔的AMB-FIP引物和AMB-BIP引物，0.2微摩尔的AMB-F3引物和AMB-B3引物，1.5毫摩尔的脱氧核糖核苷酸，8U Brt聚合酶，0.8摩尔的甜茶碱，4毫摩尔硫酸镁和2微升提取的DNA。混合物在60摄氏度条件下反应1个小时。反应最有利的特点是可以生成可见的白色沉淀物。为了进一步证明这个，1毫升在2％琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色G. intraradices的可能性。从预先培养的体外根器官培养板中选取出年龄不同的随机样本来使用。从一个高度移植的培养板中获取丛枝菌根菌根部移植大于80%，而低和中等水平的移植根样品移植率分别为5%-10%和25%-50%。丛枝菌根真菌-Gi的引物可以检测从根样品（图2）的G.?intraradices?intraradical存在，但非殖民化的根源和阴性对照没有给出信号。在早先的研究“（Gadkar和Rillig2005年）中，G.?intraradices?B -微管蛋白基因Glomeromycota体系（Corradiet al.,2004）。这也是引物，其中包括一个Gigaspora隔离（图2）。 图二。应用环介导增温DNA引物进行扩增。第一列：intraradices DAOM 181602；第二列, G. intraradices MUCL 43194, 第三列; G. proliferum; 第四列, G. lamellosum;第五列, Glomus cerebriforme;第六列, G. rosea; 第七，八和九列, 分别从胡萝卜根部移植5-10%，25- 50%，大于80%G. intraradices；第十，十一，十二和十三列，分别是G. intraradices 基因组DNA 1×10-1，1×10-2， 1×10-3 和1×10-4纳克；第十四列：没有移植胡萝卜根和第十