环介导等温扩增论文H1N1EV71HBoV和hMPV四种病毒LAMP检测方法的建立.doc

环介导等温扩增论文：H1N1、EV71、HBoV和hMPV四种病毒LAMP检测方法的建立 【中文摘要】环介导等温扩增(Loop Mediated Isothermal Amplification,LAMP),是指利用特异性引物在等温反应条件通过扩增酶的协助对模板进行周而复始的扩增过程。对于RNA核酸则为RT-LAMP。这种核酸扩增机制并不需要核酸的变复性,具有扩增时间短、效率高和特异性强等优点。因此,这种技术被更加广泛地应用于分子诊断学中,特别是病原体核酸的诊断。本研究选取近些年广泛关注的病毒:肠道病毒71型(EV71),与甲型H1N1流感病毒(A H1N1),还有两种婴幼儿呼吸道病毒:人博卡病毒(HBoV),人偏肺病毒(hMPV)为研究对象,初步建立了这四种病原的LAMP检测方法。主要获得以下结果:1、通过Align X和Primer Explorer软件得到甲型H1N1四川株LAMP引物,并进行RT-LAMP反应,研究结果显示产物酶切与理论值相符,测序鉴定结果与模板同源性为100%,不与相关病原体发生交叉反应特异度很高,灵敏度为10拷贝,用RT-PCR作为平行对照的76份临床样本检测结果显示两种方法得到同样的2份阳性样本,且测序结果吻合。初步建立了甲型H1N1流感病毒的实验室LAMP检测方法。2、通过Align X和Primer Explorer软件得到EV71安徽株LAMP引物,并进行RT-LAMP反应,研究结果显示产物酶切与理论值相符,测序鉴定结果与模板同源性为98%,不与相关病原体发生交叉反应特异度很高,灵敏度为10拷贝,252份临床样本检测中,咽拭子151份,粪拭子101份,检测结果为52份EV71阳性,其中咽拭子40份,粪拭子12份,检测结果与临床原始数据相符。初步建立了肠道病毒71型的实验室LAMP检测方法。3、通过Align X和Primer Explorer软件得到HBoV湖南株LAMP引物,并进行LAMP反应,研究结果显示产物酶切与理论值相符,测序鉴定结果与模板同源性为100%,不与相关病原体发生交叉反应特异度很高,灵敏度为10拷贝,用RT-PCR作为平行对照的76份临床样本检测结果显示两种方法得到同样的5份阳性样本,且测序结果吻合。初步建立了人博卡病毒的实验室LAMP检测方法。4、通过Align X和Primer Explorer软件得到hMPV湖南株LAMP引物,并进行LAMP反应,研究结果显示产物酶切与理论值相符,测序鉴定结果与模板同源性为98%,不与相关病原体发生交叉反应特异度很高,灵敏度为10拷贝,用RT-PCR作为平行对照的76份临床样本检测结果显示,RT-PCR阳性5份,RT-LAMP阳性7份,且测序结果吻合。初步建立了人偏肺病毒的实验室LAMP检测方法。本研究对甲型H1N1、EV71、HBoV、hMPV四种病毒所建立的LAMP检测方法具有高通量、高时效、易操作等检测优势,同时结果肉眼清晰可见,背景清晰,结果判定客观准确。本研究初步建立了这四种病毒的实验室LAMP检测方法,可以帮助临床快速诊断这四种病毒,便于基层哨点部门第一时间对这四种病毒的监测与防控,尤其是在现场检测中有很广阔的应用前景,为实现现场检测提供了实验室经验与技术支持。 【英文摘要】LAMP is short for loop mediated isothermal amplification and refers to cyclical amplification with the assistance of specific primers and polymerase in isothermal condition. This mechanism does not need denaturation or renaturation of nucleic acid and has advantage of rapid, efficient, high specificity and so on. So this method is widely used in molecular diagnostic, especially in pathogen diagnosis. This study chose A H1N1 influenza virus, enterovirus 71, human bocavirus and human metapneumovirus as object and established the LAMP detection method of these four viruses. The results as follows:1. According to H1N1 SC strain t