环境中微生物的检测和分离纯化.doc

环境中微生物的检测和分离纯化 姓名：王韬 班级：生76 组号：7-2组 同组人：袁堂谧 实验日期：2009-11-12 实验目的： 熟悉常用微生物培养基配置方法。 联系无菌操作技术。 学习单菌落划线分离法。 通过实验认识环境中微生物的分布。 实验原理： 微生物的分离与纯化：从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称微生物的分离与纯化。常用的是平板分离法。为了获得某种微生物的纯培养，一般是根据该微生物对营养、酸碱度、温度和氧的条件要求不同，而供给他们适宜的培养条件，或加入某些抑制剂造成一支其他菌生长而利于此菌生长的环境。 平板菌落计数法：平板菌落计数法是将待测样品经适当稀释，使其中的微生物充分分散成单个细菌，取一定量的稀释液接种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品的一个单细胞。该计数法最大的优点是可以获得活菌的信息。 实验材料： 土壤悬液（稀释100倍），未知菌菌落平板，无菌水，取液器，培养箱，培养皿，无菌涂棒，接种环，接种针，酒精灯。 实验步骤： 培养基的制备（提前准备）： 肉汤蛋白胨培养基： 牛肉膏 2g 蛋白胨 4g NaCl 2g 蒸馏水 400mL 琼脂 8g 称量：按上述配方称量各类物质。 溶解：在400mL水中溶解牛肉膏、蛋白胨和NaCl，混合加热溶解。 调pH值：调至7.2-7.4 过滤（本实验无需过滤） 加凝固剂：加入称量好的琼脂，混合均匀。 分装 包扎和灭菌 倒平板 从土壤中分离微生物 采土样（已事先准备）：选择较肥沃的土壤，铲去表层土，挖5-20cm深度的或特殊要求的土壤数十克，装入已灭菌的牛皮纸袋，封好袋口，做好编号记录。 制备土壤稀释液（已事先稀释至100倍）：称取1.0g，放入盛99mL无菌水并带有玻璃珠的三角瓶中，置摇床振荡5min使土壤均匀分散成土壤悬液（10-2）。 继续稀释土壤悬液至合适浓度：用无菌吸头从上述稀释液中吸取0.1mL土壤悬液，注入事先装有0.9mL无菌水的Ep管中，用同样的方法，分别配置浓度为10-3，10-4，10-5的土壤溶液。 涂布：用一只新的无菌吸头，分别吸取各浓度的土壤悬液均匀地注入装有培养基的平板上，用无菌玻璃涂棒涂匀。每个浓度3个板。 培养：将平板倒置与37℃温箱中培养24h，统计所长出的菌落数。 菌落计数 周围环境中微生物的检测 取一个平板，分成5区。做好标记（下同），分别用未洗过的、用自来水沾湿、用自来水清洗过、用肥皂清洗过和用酒精棉球擦过的手指在对应的区上轻轻涂抹（用力一致）。 取一个平板，分区，对应放入或涂上头发、牙垢、纸币和玩具。 取一个平板，置于酒精灯火焰边1min. 取一个平板，置于试验台空气中11min。 取一个平板，打开皿盖，对着培养基咳嗽。 取一个平板，分区，分别用河水，饮用水涂布。 取一个平板，用培养基轻沾一下嘴唇。 单菌落划线分离 取一个平板，分区，用接种环取未知菌种，在平板上划线。划完一边后，灼烧接种环，冷却后从上次划线的末端朝另一个方向划线。以此类推，划完各个方向。 实验结果： 土壤中的微生物平板计数结果(照片见后附录，图1-图9)： 板号 浓度 10-3 10-4 10-5 1 315 70 无法计数 2 338 无法计数 无法计数 3 无法计数 无法计数 无法计数 表1. 土壤微生物平板计数结果 按照数据选取原则，应选择浓度为10-4板的结果。由计算公式 得： 土壤中的细菌含量（个/g土壤）=70/(0.1*10-4)=7×106 周围环境中微生物的检测结果说明（照片见后附录，图12-图18）： 分别用未洗过的、用自来水沾湿、用自来水清洗过、用肥皂清洗过和用酒精棉球擦过的手指实验中，细菌最多的是用自来水沾湿的手指，用自来水清洗过的、用肥皂清洗过的、未清洗过的手指的细菌量依次递减，用酒精清洗过的手指没有细菌生长。 酒精灯火焰边放置1min的培养皿出现2个菌落，在空气中放置11min的培养皿出现10个菌落。 头发，牙垢，玩具，咳嗽和嘴唇都有细菌。纸币未发现细菌。 河水和饮用水 单菌落划线分离（照片见后附录,图10-图11）： 实验结果讨论： 土壤微生物分离实验中，3个浓度的9个板中，只有10-3的两个板和10-4的一个板的菌落可以计数。另外几个板无法计数的主要原因是细菌没有涂开，而产生了菌苔，或者因为菌落太过密集而无法区分。可以改进操作，在滴加细胞悬液时就应该分散滴加。滴加完应该涂布较长时间。涂布时最好按照一定的方向，不要随意乱涂。土壤中细