现代生化技术思考题答案(仅供参考).doc

《现代生化技术》课程思考题 绪论 1、简述生化技术的定义和主要内容。 生化技术：是生物化学及其相关学科应用的各种技术。主要是指生物体内物质及代谢产物，特别是生物大分子的分离、制备、检测及改造技术。它是一门理论与实践（验）相结合的专业技术基础课。 主要内容包括：生物大分子的分离、纯化及制备；生物体内物质及代谢产物定量和定性检测；以及生物改造技术（肽、DNA合成等）。 提取与沉淀分离技术 溶涨现象：细胞膜为天然的半透膜，在低渗溶液如低浓度的稀盐溶液中，由于存在渗透压差，溶剂分子大量进入细胞，引起细胞膜发生胀破的现象称溶胀。例如红血球置清水中会迅速溶胀破裂并释放出血红素。 自溶现象：细胞结构在本身所具有的各种水解酶如蛋白酶和酯酶等作用下，发生溶解的现象称自溶。 抽提：抽提通常是指用适当的溶剂和方法从原材料中把有效成分分离出来的过程。 盐析：一般在低盐浓度的情况下，蛋白质的溶解度随盐浓度的升高而增加，这种现象称为盐溶；而当盐浓度升高到一定程度后，蛋白质的溶解度又随着盐浓度的升高而降低，结果使蛋白质沉淀析出，这种现象称为盐析作用。在同一浓度的盐溶液中，不同蛋白质的溶解度不同，借此可达到彼此分离的目的。 等电沉淀：利用蛋白质在等电点时溶解度最低以及不同的蛋白质具有不同等电点一这特性，对蛋白质进行分离纯化的方法称为等电点沉淀法。 有机溶剂沉淀：利用不同蛋白质在不同浓度的有机溶剂中的溶解度不同而使蛋白质分离的方法，称为有机溶剂沉淀法。 细胞破碎方法可分为哪些类型？简述细胞破碎的意义。 酶学破碎法：外加酶制剂、自溶法。 机械破碎法：高速捣碎法、高速均浆法、高速磨珠法 物理破碎法：温差法、压差法、超声波 化学破碎法：有机溶剂法、表面活性剂（SDS 等）、金属螯合剂（Mg2+、Ca2+、EDTA）、化学变性剂。 何谓抽提？影响抽提的主要因素有哪些？ 抽提通常是指用适当的溶剂和方法从原材料中把有效成分分离出来的过程。 一般理想的抽提液应具备下述条件：对有效成分溶解度大，破坏作用小；对杂质不溶解或溶解度很小；来源广泛、价格低廉、操作安全等。 pH值： 改变溶质解离状态。对蛋白质或酶等具有等电点的两性电解质物质，一般选择抽提液的pH值应在偏离等电点的稳定范围内。通常碱性蛋白质选用低pH值的溶液抽提，酸性蛋白质选用高pH值的溶液抽提，或者用调至一定pH值的有机溶剂抽提。 溶剂的极性和离子强度： 有些生物大分子在极性大、离子强度高的溶液中稳定；有些则在极性小、离子强度低的溶液中稳定。 一种物质溶解度大小与溶剂性质密切相关（相似相溶原理）；离子强度通过影响溶质的带电性也影响溶质的溶解度。 降低极性：在水溶液中加蔗糖，甘油，二甲亚砜，二甲基甲酰氨。 提高离子强度：在水溶液中加中性盐（KCl, NaCl, NH4Cl, (NH4)2SO4） 水解酶： 细胞破裂后，许多水解酶释放出来。水解酶与欲抽提的蛋白质或核酸接触时，一旦条件适宜，就会发生反应，导致蛋白质或核酸分解，而使实验失败。为此，必须采用加入抑制剂，调节抽提液的pH、离子浓度或极性等方法，使这些酶丧失活性。 温度： 一般认为蛋白质或酶制品在低温(如0℃左右)时最稳定。 搅拌： 搅拌能促使欲抽提物与抽提液的接触，并能增加溶解度。但是，一般宜采用温和的搅拌方法 ，速度太快时容易产生泡沫，导致某些酶类变性失活。 氧化： 一般蛋白质都含相当数量的巯基，该基团常常是酶和蛋白质的必须基团，若抽提液中存在氧化剂或氧分子时，会使巯基形成分子内或分子间的二硫键，导致酶(或蛋白质)失活(或变性)。在提取液中加入巯基乙醇，半胱氨酸。还原性谷胱甘肽等还原剂，可防止巯基发生氧化，使蛋白，酶失活。 金属离子： 蛋白质的巯基除易受氧化剂作用外，还能和金属离子如铅、铁或铜作用，产生沉淀复合物。 这些金属离子主要来源于制备缓冲液的试剂中。 解决的办法：①用无离子水或重蒸水配制试剂；②在配制的试剂中加入1-3mmol/L的EDTA(金属离子络合剂)。 抽提液与抽提物的比例： 在抽提时，抽提液与抽提物的比例要适当，一般以5∶1为宜。如抽提液过多，则有利于有效成分的提取，但不利于纯化工序的进行。 何谓盐析？其工作原理是什么？影响盐析的主要因素有哪些？ 定义：一般在低盐浓度的情况下，蛋白质的溶解度随盐浓度的升高而增加，这种现象称为盐溶；而当盐浓度升高到一定程度后，蛋白质的溶解度又随着盐浓度的升高而降低，结果使蛋白质沉淀析出，这种现象称为盐析作用。在同一浓度的盐溶液中，不同蛋白质的溶解度不同，借此可达到彼此分离的目的。 原理：盐浓度增高到一定数值后，水活性降低，导致蛋白质分子表面电荷逐渐被中和，水化膜相继被破坏，最终引起蛋白质分子间相互聚集并从溶液中析出。 常用的蛋白质沉淀方法有哪些？盐析操