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第一章 PCR1 PCR的英文全称是什么? Polymerase Chain Reaction2 PCR是谁发明的？Kary Mullis3 PCR的基本原理是什么？ PCR的基本工作原理是以拟扩增的DNA片段为模板，以一对分别与模板DNA互补的寡核苷酸为引物，在DNA聚合酶的作用下，根据半保留复制的机制沿着模板DNA链延伸，直至新的DNA合成。不断重复这一过程，则可使目的DNA片段得到扩增。 4 PCR反应的产物中一般会生成几种长度不同的产物？反应结束时他们的含量分别是怎样的？ PCR反应中一般会产生2种不同长度的产物：一种是预期长度的产物，一种是比预期长度长得多的产物；前者以指数级数增加（2n），后者以几何级数增加（2n）。因此后者在总产物中所占比重很小，可忽略不计。 5 一般PCR反应中包括几种基本成份？它们的功能分别是什么？ 模板：待扩增的DNA或RNA；引物：与靶DNA的3’端和5’端特异性结合的寡核苷酸片段，是决定PCR特异性的关键。只有每条引物都与靶DNA特异性结合，才能保证其特异性，引物越长，特异性越高。两段引物间的距离决定了扩增片断的长度；两引物的5’端决定了扩增产物的5’端位置。说明引物决定了扩增片断的长度、位置和结果。’-OH末端,b.3’-5’外切酶活性，校正功能,c.5’-3’外切酶活性，切除错配核苷酸； 石蜡油：维持恒热和整个体系中盐浓度，减少PCR过程中尤其是变性时液体蒸发所造成的产物的丢失。 6 PCR反应对模板有什么要求（种类及质量要求等）？ 基因组DNA、噬菌体DNA、质粒DNA、cDNA、mRNA、预先扩增的DNA均可作为模板。PCR反应对模板要求不是很高，经过标准分子生物学方法制备的可以作为模板但是模板中绝对不能含有蛋白酶、核酸酶、Taq酶抑制剂和任何可以结合DNA的蛋白；虽然片段长短不是影响PCR效率的关键因素，短片段模板PCR效率更高；为保证反应的特异性，应使用ng级的克隆DNA、μg级的单拷贝染色体DNA、或104拷贝的待扩增片段。 7 什么叫PCR的引物？什么叫特异性引物？什么叫简并性引物？ DNA序列互补的寡核苷酸片段，两引物间距离决定扩增片段的长度，两引物的5’端决定扩增产物的5’末端位置。(引物要大大过量) 特异性引物：引物是与靶DNA的3’端和5’端特异性结合的寡核苷酸片段，是决定PCR特异性的关键。只有当每条引物都能特异性地与模板DNA中的靶序列复性形成稳定的结构，才能保证其特异性。 简并性引物：简并引物是指代表编码单个氨基酸所有不同碱基可能性的不同序列的混合物。为了增加特异性,可以参考密码子使用表,根据不同生物的碱基使用偏好,减少简并性。 8 引物设计的基本原则有哪些？ 引物长度一般在20～24bp：这样长度的引物保证了不易形成杂合体； （G+C）%：两段引物的此数值应相近；在已知模板序列时应与模板的相近。 引物本身不能形成明显的次级结构，如发卡结构； 两引物不可’端，若不可避免那3’端互补碱基不可超过2个碱基)； ’端配对：引物3’端为DNA聚合酶连上寡核苷酸的地方，因此。 9 PCR中使用的DNA聚合酶有哪几种，各具有哪些特点？ Klenow片段：为DNA聚合酶Ⅰ的片段，有聚合酶活性和3’~5’外切酶活性； Taq酶：耐热DNA聚合酶，可耐受93～95摄氏度，是PCR普及的关键。它避免了不断补加DNA聚合酶的繁琐操作，提高了退火和延伸的温度，减少了非特异性产物和DNA二级结构，提高了PCR的特异性、敏感度和产量。它没有3’~5’外切酶活性，无校对功能。 Stoffel片段：第二代耐热DNA聚合酶，’~3’外切酶活性，将97.5摄氏度的半衰期提高到20min，而Taq酶只有5min；对复合PCR（2个或以上模板位点的PCR）更有效； Vent酶：耐受100摄氏度以上高温达2h；具有校对功能3’~5’外切酶活性)。 RTth 逆转录酶：有依赖于RNA的耐热DNA聚合酶活性和依赖于DNA的耐热DNA聚合酶活性，这两种活性分别依赖于Mn2+和Mg2+。 CR反应中对于加入的dNTP有什么要求？ dNTP应具有一定浓度：μmol/L, 不得低于10-15。浓度过高会抑制Taq酶活性，较低浓度可降低错误掺入浓度错误掺入，浓度过低会导致产量过低； ，否则会诱导聚合酶错误掺入而降低产率、提前终止反应； 不能反复冻融，否则会降解。11 PCR反应中加入的二价阳离子有什么功能？常用的是什么离子？ 缓冲液中二价阳离子的存在至关重要，因为耐热DNA聚合酶需要游离的二价阳离子作为辅助离子，它影响着PCR的产量和特异性。常用Mn2+和Mg2+。 12 PCR反应一般分为几个步骤？各步骤有什么特点？ A变性：双链DNA变成单链DNA。变性温度的高低由GC含量决定；变性时间由D