现代生物技术崔景荣部分王东版.doc

崔景荣部分 4 PCR多聚酶链式反应技术 4.1 概述 通过耐热的DNA聚合酶，在生物体外进行的链式DNA合成反应，用于扩增特定的DNA片段。 应用：农业、生物、古生物学（分析标本）、动物学（遗传病学诊断）、法医学（现场标本分析）、医药（研究、诊断、基因工程） 4.2 PCR技术原理 PCR技术： 条件：原料——模板DNA、引物、4种脱氧核糖核苷酸，工具——DNA聚合酶，缓冲液环境 实质：体外的酶促DNA合成反应 反应步骤：变性（denaturation），退火（annealling），延伸（extension） 4.3技术操作程序 原料：ddH2O，缓冲液，dNTP，引物、DNA模板 过程： 混匀、离心(加石蜡油(冷致延伸温度(加TaqDNA酶(开始第一个循环反应 (重复反应循环25-30次(电泳检测扩增产物 循环反应：[变性：94℃，30s；退火55℃，30s；延伸：70-72℃，30-60s] 变性：利用约94℃的高温，使双链DNA分离，仅以单链形式存在。该步骤时间30s。 退火：降低温度使得引物可以结合于单链DNA上。此阶段的温度低于Tm 5℃：Tm = 4(G+C) + 2(A+T)，时间30s。 延伸：DNA聚合酶由降温时结合上的引物开始沿着DNA链合成互补链。此阶段的温度一般约需72℃，合成2kbp大概需要1分钟。 4.4 PCR条件的优化 (1) 模板 来源：临床标本，细胞或微生物标本，病理标本，犯罪现场标本。 优化：使用DNA聚合酶抑制剂、蛋白酶、核酸酶、结合DNA的蛋白质。 (2) 引物 引物设计原则：长度15-30bp，G+C含量：40-60%，尽量避免碱基之间以及自身互补，引物的3’端不能有修饰，5’端可修饰。 引物的纯化：合成-电泳/HPLC纯化-冻干—20℃保存 (3) 缓冲液：KCl 10-50mmol/L [缓冲液组成[KCl, Tris-HCl, MgCl, 明胶] (4) Mg离子浓度：最佳浓度1.5mmol/L Mg离子浓度过高-酶催化非特异性扩增，Mg浓度过低-酶活力降低 (5) 三磷酸脱氧核苷酸：最佳浓度为50-200?mol/L 高浓度时错误掺入/酶抑制，低浓度时降低产量 (6) 耐热DNA聚合酶：最佳浓度为1-2.5IU [0.5-5.0IU]较高-非特异，较低-产量低 (7) 温度循环参数 变性温度与时间(成败关键)：30s@95℃，15s@97℃ 复性温度与时间：低于Tm值5℃，Tm=4(G+C)+2(A+T)，复性时间过长增加非特异性 延伸温度与时间：72℃，1kb@1min，3-4kb@3-4min。 (8) 其他 4.5 PCR产物分析 凝胶电泳法；核酸探针法（膜印迹杂交）；微孔板夹心杂交法；PCR-酶连免疫吸附分析法；序列分析法 微孔板夹心 相比 膜印迹杂交：本底低；易操作，时间短，固定DNA不需加热。 4.6 应用 实验一：肿瘤细胞的基因表达 对正常细胞和肿瘤细胞的mRNA，分别制备其cDNA文库，并通过PCR扩增，对比转录基因构成。 实验二：药物对基因表达的影响 对正常细胞和药物作用细胞的，通过PCR扩增其核酸物质，研究药物对基因表达的影响。 实验三：端粒酶活性的研究 从Hela细胞系中提取端粒酶，通过TRAP-PCR(端粒酶重复序列扩增法(TRAP))，检测端粒酶活性。 实验四：基因工程药物的制备/鉴定 A1核心技术包括： 目的基因的获取——PCR， 目的基因与载体的连接——基因重组， 重组DNA转入宿主细胞——转导（真核细胞）、转染（原核细胞）、转化（原核细胞直接获取DNA）等， 筛选与鉴定重组体——生化分析， 表达目的基因及产物纯化——细胞培养和物质分离技术。 A2后处理过程和技术： 蛋白质的分离纯化，蛋白质的修饰及后加工技术，中试的研究技术，扩大生产规模的研究技术。 B基因工程药物 B1基因工程疫苗：HBV，HAV，幼畜腹泻基因工程疫苗。 B2多肽和蛋白质：干扰素、红细胞生成素、生长因子 B3 肿瘤疫苗… 实验五：基因工程 转基因细胞系的建立、转基因动物的建立 4.7 衍生PCR技术及应用 RT-PCR：把核算扩增、杂交、光谱分析和实时检测技术结合在一起，借助于荧光信号来检测PCR产物。一方面提高了灵敏度，另一方面还可以做到PCR每循环一次就收集一个数据，建立实时扩增曲线，准确地确定CT值，从而根据CT值确定起始DNA的拷贝数，做到真正意义上的DNA定量。第代差异显示系统 DDRT-PCR（mRNA差异显示技术）：利用3’段PolyA结构，直接扩增真核细胞第二代差异显示系统RFDD-PCR（限制性酶切片段差异显示）：很有效的改进，可以产生结果一致的基因表达图谱，重点放大和展示编码区，对原核及真核RNA都有用，大大消除假阳性。 5.1 概述 5.2 基因