琼脂糖凝胶电泳常见问题.doc

人体内血液采集到采血袋内所形成的混合物称为全血 头发不是器官，不含神经、血管和细胞 蛋白酶k是一种枯草蛋白酶类的高活性蛋白酶，用于生物样品中蛋白质的一般降解 使用苯酚抽提细胞 DNA 时，苯酚的作用是使蛋白质变性，同时抑制了 DNase 的降解作用。用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与 DNA 联结键已断，蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而 DNA 溶于水相。 氯仿的作用是克服酚的缺点；加速有机相与液相分层。 最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的迹量酚。 （酚易溶于氯仿中） TE缓冲液是一种能在加入少量酸或碱时抵抗pH改变的溶液 氯仿抽提后通过离心清除多糖、多酚和蛋白，然后基因组DNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜， 再通过一系列快速的漂洗－离心的步骤, 进一步将多糖，多酚和细胞代谢物，蛋白等杂质去除， 最后低盐的洗脱缓冲液将纯净基因组DNA从硅基质膜上洗脱。 裂解细胞的话：新鲜配制冷的 RIPA 裂解缓冲液:先配150 mM NaCL+ 1% NP-40 (去垢剂) + 0.1% SDS (去垢剂)+2ug/ml Aprotinin (蛋白酶抑制剂) (使用前加入)+2ug/ml Leupeptin (蛋白酶抑制剂) (使用前加入)或1 mM PMSF (蛋白酶抑制剂)+1.5 mM EDTA (蛋白酶抑制剂)+1mM NaVanadate (磷酸脂酶抑制剂) 酚中含有醌等氧化物，这些产物可引起磷酸二酯键的断裂及导致RNA和DNA的交联一种为Tris饱和酚（pH7.8左右），故也称为碱性酚。另一种就是酸性酚，也就是水饱和酚。用于RNA提取时，则要制备酸性酚，也就是水饱和酚，因为在酸性条件下，RNA被分配于水相，而DNA在有机项，从而达到分离获得RNA的目的。 核酸分解的第一步是水解核苷酸之间的磷酸二酯键，在高等动植物中都有作用于磷酸二酯键的核酸酶 甲基化酶是作为限制与修饰系统中的一员，用于保护宿主?DNA?不被相应的限制酶所切割 特 性 I 型酶 II 型酶 III 型酶 辅助因子 ATP、Mg2+、S-腺苷甲 Mg2+ ATP、Mg2+、(S-腺 寄主特异性位点序列 EcoB:TGANTGCT 旋转对称 EcoP1:AGACC 切割位点 距特异性位点至少 位于特异性位点 距特异性位点 DNA易位作用 能 不能 不能 甲基化作用的位点 寄主特异性的位点 寄主特异性的位点 寄主特异性的位点 序列特异性切割 不是 是 是 在DNA克隆中的用途 无用 十分有用 有用 大多数Ⅱ型酶切割位点的一个显著特点是它们具有双重旋转对称的结构或称回文序列(palindrome)。　　切割片段末端的特点：一种是形成粘性末端，它们能够通过互补碱基间的配对重新环化。另一种是形成具有平末端的DNA片段，这种片段则不易于环化。 虽然不同限制酶识别不同靶序列，它们产生的粘性末端可以彼此连接起来，然而应注意的是它们重组后所形成的序列结构却不能再被原来的任何一种同尾酶所识别。 琼脂糖凝胶是依靠糖链之间的次级链如氢键来维持网状结构 用带电粒子在电场中移动速度不同而达到分离的技术称为电泳技术 但是当DNA分子大小超过20kb时，普通琼脂糖凝胶就很难将它们分开。此时电泳的迁移率不再依赖于分子大小 母婴保健 养生小常识 wk_ad_begin({pid : 21});wk_ad_after(21, function(){$(.ad-hidden).hide();}, function(){$(.ad-hidden).show();}); 出现片状拖带或涂抹带PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量 差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：减少酶量，或调换另一来源的酶。减少dNTP的浓度。适当降低 Mg2+浓 度。增加模板量，减少循环次数。 TRIZOL?试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA 的试剂。它在破碎和溶解细胞时能保持RNA 的完整性。加入氯仿后离心，样品分成水样层和有机层。RNA存在于水样层中。 核糖核酸酶（Ribonuclease, RNase）是一类催化RNA降解为小片段的核酸酶 RNasin和DEPC都是RNA酶抑制剂,为什么提取RNA时不用RNasin来去除RNA酶 RNasin一般多为蛋白质，如果把它用与RNA提取过程，你想得用多少啊，再者说，常温操作也容易失活 用酚抽提细胞DNA时，有什么作用？使蛋白质变性，同时抑制了DNase的降解作用。用苯酚处理匀浆液时，由于蛋白与DNA 联结键已断，蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而D