生化教案2.doc

牛血清醋酸纤维素薄膜电泳 目的要求 掌握醋酸纤维素薄膜电泳的基本原理及操作过程。 了解牛血清蛋白质的各种成分。 熟悉牛血清中各种蛋白质相对含量的测定原理和方法。 熟悉分光光度计的工作原理及使用方法。 实验原理 电泳的基本原理 电泳是指带电颗粒在电场的作用下发生迁移的过程。许多重要的生物分子，如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等都具有可电离基团，它们在某个特定的pH值下可以带正电或负电，在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷极性相反的电极方向移动。电泳技术就是利用在电场的作用下，由于待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而对样品进行分离、鉴定或提纯的技术。 电泳过程必须在一种支持介质中进行。自由界面电泳没有固定支持介质，所以扩散和对流都比较强，影响分离效果。样品在固定的介质中进行电泳过程，减少了扩散和对流等干扰作用。最初的支持介质是滤纸和醋酸纤维素膜，由于pH值的改变会引起带电分子电荷的改变，进而影响其电泳迁移的速度，所以电泳过程应在适当的缓冲液中进行，缓冲液可以保持待分离物的带电性质的稳定。 醋酸纤维素薄膜 醋酸纤维素是纤维素的羟基乙酰化所形成的纤维素醋酸酯，将它溶于有机溶剂（如：丙酮、氯仿、氯乙烯、乙酸乙酯等）后，涂抹成均匀的薄膜,待溶剂蒸发后则成为醋酸纤维素薄膜。该膜具有均一的泡沫状的结构，厚度约为120 μm，有很强的通透性，对分子移动阻力很小。本实验采用醋酸纤维素薄膜作为介质。 蛋白质 蛋白质是由氨基酸组成的，其分子中除两端的游离氨基和羧基外，侧链中尚有一些解离基，作为带电颗粒它可以在电场中移动，移动方向取决于蛋白质分子所带的电荷。蛋白质颗粒在溶液中所带的电荷，既取决于其分子组成中碱性和酸性氨基酸的含量，又受所处溶液的pH影响。当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质游离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，此时溶液的pH值称为蛋白质的等电点。处于等电点的蛋白质颗粒，在电场中并不移动。各种蛋白质分子由于所含的碱性氨基酸和酸性氨基酸的数目不同，因而有各自的等电点。 凡碱性氨基酸含量较多的蛋白质，等电点就偏碱性。反之，凡酸性氨基酸含量较多的蛋白质，等电点就偏酸性。蛋白质是两性电解质，在pH值小于其等电点的溶液中，蛋白质为正离子，在电场中向阴极移动；在pH值大于其等电点的溶液中，蛋白质为负离子，在电场中向阳极移动。 血清中含有数种蛋白质，它们所具有的可解离基团不同，在同一pH的溶液中，所带净电荷不同，故可利用电泳法将它们分离。血清中含有白蛋白、α-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白等，各种蛋白质由于氨基酸组成、立体构象、相对分子质量、等电点及形状不同，在电场中迁移速度不同。由表可知，血清中5种蛋白质的等电点大部分低于pH值7.0，所以在pH=8.6的缓冲液中，它们都电离成负离子，在电场中向阳极移动。本实验采用pH=8.6的巴比妥-巴比妥钠溶液作为电泳的缓冲溶液。 蛋白质名称 等电点（PI） 相对分子质量 白蛋白 4.88 69000 α1-球蛋白 5.06 200000 α2-球蛋白 5.06 300000 β-球蛋白 5.12 90000~150000 γ-球蛋白 6.85~7.50 156000~300000 4.分光光度计的工作原理 溶液中的物质在光的照射激发下，产生了对光吸收的效应，物质对光的吸收是具有选择性的，各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱，因此当某单色光通过溶液时，其能量就会被吸收而减弱，光能量减弱的程度和物质的浓度有一定的比例关系，也即符合于比色原理---比耳定律。 当入射光，吸光系数和溶液液层厚度不变时，透光率或吸光度只随溶液浓度变化而变化。因此把透过滤液的光经过测光系统中的光电转化器，将光能转化为电能，就可以在测光系统的指示器上显示出相应的吸光度和透光率。 在一定范围内，蛋白质的含量与结合的染料量成正比，故可将蛋白质区带剪下，分别用0.4mol/L NaOH溶液浸洗下来，进行比色，测定其相对含量。也可以将染色后的薄膜直接用光密度计扫描，测定其相对含量。本实验采用分光光度计测定各种蛋白质含量。 实验仪器与试剂 实验仪器 电泳仪、点样器、分光光度计、剪刀、滤纸、镊子、培养皿、试管架、试管、洗耳球、吸量管、玻璃板 实验试剂 巴比妥缓冲液（pH8.6，离子强度0.06）：称取巴比妥1.66克和巴比妥钠12.76克，溶于少量蒸馏水中，定容至1000毫升。 染色液：称取氨基黑10B 0.5克，加入蒸馏水40毫升、甲醇50毫升和冰醋酸10毫升，混匀，保存备用。 漂洗液：量取95%乙醇45毫升，冰醋酸5毫升和蒸馏水50毫升，混匀，保存备用。 NaOH溶液（0.4N）：称取NaOH 16克，用少量蒸馏水溶解后定容至1000毫升。 实验步骤