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生化综合实验报告测定蛋白质含量的三种方法及其比较
本科学生综合性实验报告
学号 姓名
学院 专业、班级
实验课程名称 测定蛋白质含量的三种方法及其比较
教师及职称
开课学期 至学年 学期
填报时间 年 月 日
云南师范大学教务处编印
实验序号 十~十二 实验名称 测定蛋白质含量的三种方法及其比较 实验时间 2012/11/16~2012/11/30 实验室 睿智楼3幢331(生物技术实验室4) 1.实验目的:
⑴掌握双缩脲法定量测定蛋白质含量的原理和方法。
⑵掌握考马斯亮蓝法定量测定蛋白质含量的原理和方法。
?⑶掌握紫外吸收法定量测定蛋白质含量的原理和方法。
⑷比较三种定量测定方法的异同。 2. 实验原理、实验流程或装置示意图
(1)双缩脲法 (Biuret 法)测定蛋白质浓度
原理:在碱性溶液中,双缩脲(H2N-CO-NH-CO-NH2)与Cu2+作用形成紫红色的络合物,这一反应称双缩脲反应。具有两个或两个以上肽键的化合物都有双缩脲反应,因此蛋白质在碱性溶液中,也能与Cu2+形成紫红色络合物,颜色深浅与蛋白质浓度成正比,而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关,故可用比色法测定蛋白质的浓度。
在一定条件下,未知样品的溶液与标准蛋白质溶液同时反应,并于540nm下比色,可以通过标准蛋白质的标准曲线求出未知样品的蛋白质浓度。测定范围为1~10mg蛋白质。
(2)考马斯亮蓝染色法测定蛋白质浓度( Bradford 法)
原理:考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度,属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G-250(coomassie brilliant blue,CBB)在游离状态下呈红色,当它与蛋白质结合后变为蓝色,在一定蛋白质浓度范围内,蛋白质.色素结合物在595 nm波长下的光吸收符合比尔定律,故可用于蛋白质的定量分析。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合2min左右达到平衡。该反应非常灵敏,可测微克级蛋白质含量。
(3)紫外吸收法测定蛋白质浓度
原理:白质具有吸收紫外线的性质,吸收高峰在280nm波长处。在此波长范围内,蛋白质溶液的光吸收值(O.D280)与其含量呈正比关系,可用作定量测定。
3.实验设备及材料
(1)双缩脲法
实验器材:
①容量瓶 ②试管、试管架
③恒温水浴槽 ④吸量管
⑤分光光度计 ⑥电热套
⑦锥形瓶 ⑧比色皿
实验试剂:
①标准酪蛋白溶液: 用0.05 mol/L NaOH溶液配制。酪蛋白要预先测定其蛋白质纯度,再根据其纯度配制成标准溶液。也可用牛血清蛋白或卵其清白蛋白配制标准蛋白溶液。
②双缩脲试剂: 溶解1.5g CuSO4·5H2O和6.0g NaKC4H4O6·4H2O于500ml蒸馏水中,在搅拌下加入300 ml 10% NaOH溶液,用蒸馏水定容到1升刻度,混匀备用。
一.实验设计方案
③蛋白质样品或蛋白质样品溶液。
(2) 考马斯亮蓝染色法
试剂:
①考马斯亮蓝试剂: 考马斯亮蓝G-250 100mg溶于50 ml 95%乙醇中,加入100ml 85%磷酸,用蒸馏水稀释至1000 ml。
②标准蛋白质溶液: 牛血清蛋白或卵其清白蛋白等,预先测定其蛋白纯度,再根据纯度用蒸馏水或0.9%NaCl 准确配制。
器材:
①容量瓶 ②试管及试管架
③恒温水浴槽 ④吸量管
⑤分光光度计 ⑥电热套
⑦锥形瓶 ⑧比色皿
(3) 紫外吸收法
试剂:
样品蛋白溶液:准确称样品蛋白质,配制成一定浓度的溶液。
器材:
①紫外分光光度计 ②容量瓶
③试管、试管架 ④吸量管
⑤锥形瓶 ⑥比色皿
4.实验方法步骤及注意事项
双缩脲法
标准曲线的绘制:
取12支试管分成两组,按下表平行操作,绘制标准曲线。
样品测定:
①制备样品的蛋白质提取液。
②取出两份1.0 ml样品液。操作同标准曲线,测定样品的OD值,平行两份
计算:
取两组测定的平均值计算。
从标准曲线上查出其蛋白质浓度,再根据样品称重量和稀释倍数计算样品的蛋白质含量。
注意事项:
Tris 、铵盐对测定有干扰,有大量脂肪性物质同时存在时,会产生混浊的反应混合物。
考马斯亮蓝染色法
标准
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