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实验四 玉米超氧化物歧化酶（SOD）的提取 及活性测定 一、本实验的教学目标及基本要求 1．通过玉米超氧化物歧化酶（SOD）的提取及活性测定，掌握硫酸铵盐析沉淀蛋白质及超滤浓缩蛋白质的方法和原理，比较二者的特点。 2．掌握测定超氧化物歧化酶（SOD）的活力和比活力的方法。 二、本实验的教学内容 （一）实验原理 超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，简称SOD），它广泛存在于各类生物体内，按其所含金属离子的不同，可分为3种：Cu,Zn-SOD，Mn-SOD，Fe-SOD。SOD催化如下反应： 在生物体内，它是一种重要的自由基清除剂，能治疗人类多种病症、放射病、自身免疫性疾病和抗衰老，对生物体有保护作用。在玉米中，SOD主要存在胚芽中，当将萌发的玉米籽粒打浆破碎后，以中性盐沉降其蛋白质部分，SOD就存在于沉淀中，但其中有许多杂蛋白，因此在盐析时先用40% (NH4)2SO4去除杂蛋白部分，再用90% (NH4)2SO4饱和上清液，则其中SOD成分即被浓缩分离。 超滤也是一种蛋白质浓缩方法。超滤的工作原理是运用液压迫使溶质透过膜并按溶质分子量、形状、大小的差异，把大溶质分子阻留在膜的一侧，而小分子溶质则随溶剂透过膜到另一侧，使大小溶质分子得到分离。利用此原理只要选择适当的超滤膜即可将玉米浆中SOD与其它小分子杂蛋白、可溶性糖等分离，并去除水份，得到SOD浓缩液。 SOD活性测定采用NBT光还原法。其原理为核黄素在有氧条件下能产生超氧自由基负离子O2-，当加入NBT后，在光照条件下，与超氧自由基反应生成单甲月替（黄色），既而还原成二甲月替（呈兰色）。该产物在560nm下有最大吸收峰。当加入SOD时，可以使超氧自由基与H+结合生成H2O2+O2，从而抑制了NBT光还原的进行，使兰色二甲月替 生成速度减慢。通过加入不同量的SOD，一定时间后测定560nm光密度的变化，求出抑制NBT光还原的50%的酶液量作为一个酶活力单位。 （二）　主要实验材料、试剂和仪器 1．实验材料： 玉米籽粒。 2．试剂：注意配好每一试剂时，应立即转入试剂瓶当中，不要将试剂放在容量瓶当中存放，一定要及时将试剂瓶贴好相应的标签，标明溶液的浓度、pH值、体积、试剂名称、配制时间、配制人。配制时一定要标清，使用时注意不要将其弄掉，这一点将给您带来无比的快捷和方便。 （1）1％次氯酸钠：10mL次氯酸钠于1 000mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度。 （2）提取缓冲液：0.05mol/L磷酸氢二钾—磷酸二氢钾缓冲液，pH7.8。 具体配制方法如下：首先是1mol/L pH7.8的磷酸钾缓冲液母液的配制。 a. 1mol/L KH2PO4溶液：称取13.6g KH2PO4，置于50mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度。 b. 1mol/L K2HPO4溶液：称取22.8g K2HPO4，置于50mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，可稍加热，移入100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度。 c. 取5mL a 液与55mL b液混合后，调节pH为7.8，该液即为1 mol/L的磷酸钾缓冲液。 d. 0.05 mol/L pH7.8 磷酸钾缓冲液的配制 （内含1mmol/L EDTA及0.1% β-巯基乙醇）：称取EDTA·2Na·2H2O 0.372g置于50mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入1 000mL容量瓶中，用移液管吸取1mL β-巯基乙醇置入该1 000mL容量瓶中，用50mL量筒量取50mL c液至该1 000mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度。 （3）测试缓冲液：0.026mol/L Met—磷酸钠缓冲液 具体配制方法：首先是0.1mol/L pH7.8 Na2HPO4—NaH2PO4缓冲液的配制。 a. 称取Na2HPO4·12H2O（MW=358.14）3.5814g于100mL小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后，移入100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度。 b. 称取NaH2PO4·2 H2O（MW=156.01）0.780g于50mL小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后，移入50mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度。 量取91.5mL a液与8.5mL b液混合后，该液即为0.1mol/L pH7.8的磷酸钠缓冲液。 称取L-Met（MW=149.2）0.1 941g于50mL小烧杯中，用少量0.1 mol/L pH7.8磷酸钠缓冲液溶解后，移入50mL容量瓶中，用0.1 mol/L pH7.8磷酸钠缓冲液定容至刻度。 （4）7.5×10-4mol/L氯化硝基四氮唑蓝（NBT） 称取NBT（MW=817.7）0.0 613g于50mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移至100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻