生物制药产业化及膜分离技术,下游纯化解决方案专帖.doc

生物制药产业化及膜分离技术，下游纯化解决方案专帖！ 想知道震动膜的工作原理，能否相告呢？发邮件到xxx@126.com。谢谢了先！ yangzhiming wrote:非常感谢您的回复,我现在是利用RP-HPLC制备,纯度只能达到90%,也使用过离子色谱,效果也不好.主要是和主峰保留时间非常接近的杂质难以分离,不知用什么预处理方法,请您指教.多谢! IEC-HPLC不是很好操作，条件控制比较难，相对来说，RP-HPLC会好些。样品的预处理，当然有很多。比如脱盐，根据你的量选择合适的方法超滤手段脱盐。比如去除大分子蛋白，你也可以选择超滤。要是浓度不够，可以用超滤浓缩。另外，RP-HPLC的梯度选择比较重要，在选择好柱子后，然后考虑合适的梯度去完成实验，到底什么样的梯度最好，需要你去优化。洗脱剂的选择也是很重要的，不同洗脱剂效果是不一样的。比如乙氰和甲醇是不一样的。 初学者请问：我们用miliipore的板式膜包纯化蛋白，目的蛋白的分子量是11kd，选择的膜包的分子量是30kd，没有压力表，靠流速来控制压力，逐级PBS洗滤，在不同 时间分别取截留和透过液，进行SDS电泳，结果发现大部分的目的蛋白还在截留中，透过了不到五分之一，而且透过液中的杂蛋白不少，分子量大于30kd的也有，超滤的效果很差。我们的样品上样前经过了0.22um的膜过滤。膜用的是新膜。后来，我们又换了50kd的膜包。发现结果和30kd的膜包差不多，大部分的目的蛋白被截留了，这是什么原因呀？难道是样品过0.22um的膜后进行超滤，膜包在很短的时间又被堵了吗？还有，我做过的另一个试验，处理的样品是培养的上清，我们离心收集上清后，过膜上样，用30kd的膜包的进行分离，得到的结果也不理想，收集的上清液进行SDS电泳，条代模糊，感觉好像盐离子浓度很高，难道是把培养基的成分也截留了?希望楼主能帮帮忙！ aeve wrote:初学者请问：我们用miliipore的板式膜包纯化蛋白，目的蛋白的分子量是11kd，选择的膜包的分子量是30kd，没有压力表，靠流速来控制压力，逐级PBS洗滤，在不同 时间分别取截留和透过液，进行SDS电泳，结果发现大部分的目的蛋白还在截留中，透过了不到五分之一，而且透过液中的杂蛋白不少，分子量大于30kd的也有，超滤的效果很差。我们的样品上样前经过了0.22um的膜过滤。膜用的是新膜。后来，我们又换了50kd的膜包。发现结果和30kd的膜包差不多，大部分的目的蛋白被截留了，这是什么原因呀？难道是样品过0.22um的膜后进行超滤，膜包在很短的时间又被堵了吗？还有，我做过的另一个试验，处理的样品是培养的上清，我们离心收集上清后，过膜上样，用30kd的膜包的进行分离，得到的结果也不理想，收集的上清液进行SDS电泳，条代模糊，感觉好像盐离子浓度很高，难道是把培养基的成分也截留了?希望楼主能帮帮忙！ 您提的问题很好。谢谢您的问题！正好就您的这个问题，我把膜包的选择原则说明一下，好供大家参考。一般地，在没有任何实验或者经验的基础上，选择膜包以3~6倍为经验值。举例：您的11K目标蛋白，如果选择与大分子蛋白分离的话，则选择33~66K标示量的膜包，商品膜包为50K或者100K的比较好。根据您所描述，30K肯定是不合适的。但是50K则不应该这样。如果您的目的是脱盐，或者更换缓冲液的话，那么选择11K/3~6=2~3K，商品有3K和1K的。一般说来3K可以满足的话，就不选择1K，因为通量3K比1K大。再者，有极端的情况，就是目标蛋白是线性分子，那么这个时候选择的系数要大一些，比如选择6。另外PH值 影响蛋白存在状态。还有，提醒一下，如果A家产品实验效果不好的话，可以考虑B家，不同的厂商膜的透过曲线是不一样的，甚至差别很大的。需要您把具体的情况和比较专业的人员交流，共同解决。另外膜包的材质要考虑，有些材质对于蛋白的吸附是比较厉害的，不适合蛋白的应用。正确操作下，膜不应该那么容易堵塞，即便堵塞，2种膜的动力学过程也不是一样的。还有，上游的盐浓度不应该很高，或者您超滤的时间短导致，或者操作有问题。您是怎么判断盐浓度的高低？用超滤膜脱盐得到样品液上离子交换柱，或者SDS是超滤经常的应用之一。细节问题，可和我进一步交流。PM或者电话给我。祝成功！ 非常感谢楼主这么快时间内就回复了！我们用milipore的膜包不行的情况下，重新选择了另一家外国公司的产品，这次我们定的是20ml的超滤离心管（30kd）。SDS的电泳结果提示超滤的效果非常不错：大部分的目标蛋白被透过了，杂蛋白的量也不是很多。我们从一开始就选择的是低蛋白吸附性的膜，milipproe定的是再生纤维素的，离心管定的是聚醚砜的，两家公司都说是低蛋白吸附性的