生物化学实验二DNA的琼脂糖凝胶电泳.doc

生物化学实验二：DNA的琼脂糖凝胶电泳 指导教师：李玉芹 一、目的 通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术。 二、 原理 琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的常用方法。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应，DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。在琼脂糖溶液中加入低浓度的溴化乙锭（ethidum bromide ,EB），在紫外光下可以检出 10ng的DNA条带，在电场中，pH8.0条件下，凝胶中带负电荷的DNA向阳极迁移。 琼脂糖凝胶有如下特点： (1) DNA的分子大小 在凝胶基质中其迁移速率与碱基对数目的常用对数值成反比，分子越大迁移得越慢。 (2) 琼脂糖浓度 一个特定大小的线形DNA分子,其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA电泳迁移率(u)的对数与凝胶浓度(t)成线性关系。 (3) 电压 低电压时，线状DNA片段迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加，不同分子量DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长，随着电压的增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率达到最大，所加电压不得超过5v/cm。 (4) 电泳温度 DNA在琼脂糖凝胶电泳中的电泳行为受电泳时的温度影响不明显，不同大小的DNA片段其相对迁移速率在4℃与30℃之间不发生明显改变，但浓度低于0.5%的凝胶或低熔点凝胶较为脆弱，最好在4℃条件下电泳。 (5) 嵌入染料 荧光染料溴化乙锭用于检测琼脂糖凝胶中的DNA，染料嵌入到堆积的碱基对间并拉长线状和带缺口的环状DNA,使其刚性更强,还会使线状迁移率降低15%。 (6) 离子强度 电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA电泳迁移率。在没有离子存在时（如误用蒸馏水配制凝胶，电导率最小，DNA几乎不移动，在高离子强度的缓冲液中（如误加10×电泳缓冲液），则电导很高并明显产热，严重时会引起凝胶熔化。 对于天然的双链，常用的几种电泳缓冲液有TAE、TBE等，一般配制成浓缩母液，室温保存，用时稀释。 三、主要仪器 1. 恒温培养箱 2. 琼脂糖凝胶电泳系统 3. 微波炉 4. 紫外线透射仪 四、试剂 1.三羟甲基氨基甲烷（Tris） 2.硼酸 3.乙二胺四乙酸(EDTA) 4.溴酚蓝 5.蔗糖 6.琼脂糖 7.溴化乙锭 8.DNA marker 9.DNA样品 五、实验步骤 1.缓冲液的配制 ① 5×TBE(5倍体积的TBE贮存液) 配1000ml 5×TBE: Tris 54g 硼酸 27.5g 0.5mol/l EDTA 20ml Ph8.0 ② 凝胶加样缓冲液(6×) 溴酚蓝 0.25% 蔗糖 40% ③溴化乙锭溶液(EB) 0.5μg/ml 2.制备琼脂糖凝胶 按照被分离DNA的大小,决定凝胶中琼脂糖的百分含量。可参照下表： 琼脂糖凝胶浓度 线性DNA的有效分离范围 0.3% 5-60 kb 0.6% 1-20 kb 0.7% 0.8-10 kb 0.9% 0.5-7 kb 1.2% 0.4-6 kb 1.5% 0.2-4 kb 2.0% 0.1-3 kb 3.胶板的制备 (1) 用高压灭菌指示纸带将洗静、干燥的玻璃板的边缘（或电泳装置所皿备的塑料盘