生物化学实验基本知识.doc

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生物化学实验基本知识

生物化学实验基本知识 实验室要求 一、 实验课的目的 1、加深理解:加深对生物化学基本理论的理解。 2、掌握技术:掌握生物化学的基本实验方法和实验技术(四大基本技术:离心、电泳、层析、比色)及分子生物学的一些基本技术和方法。 3、培养能力:培养学生的思维能力、动手能力和表达能力。 4、掌握精髓:科学的精髓是实事求是、敢于探索、善于创新的精神,要对实验中出现的一切反常现象进行讨论,并大胆提出自己的看法。 二、 生化实验室规则和要求 1、预习: 课前要预习实验教材,了解实验目的、原理,熟悉操作规程。 2、秩序: 自觉遵守纪律,维护教学秩序,不准迟到、早退,保持安静,严禁谈笑打闹,听从教师指导,未经教师同意,不得随意离开实验室。 3、整洁: 搞好实验环境和仪器的卫生整洁,实验台面必须保持整洁,仪器药品要井然有序,公用试剂用毕,应立即盖严放回原处,勿使药品试剂撒在实验台面和地面。实验完毕,需将药品试剂排列整齐,仪器要洗净倒置放好。固体废物,如滤纸、棉花、血块不得倒入水池中,以免堵塞下水道;一般性废液可倒入水池中冲走,但强酸强碱或有毒有害溶液必须用水高度稀释后,方可倒入水池中,同时放水冲走,以免腐蚀水管。全体同学由班长安排轮流值日,负责当天实验室卫生、安全和一些服务性工作,经教师验收合格后,方可离开实验室。 4、节约: 使用仪器、药品、试剂及各种物品必须厉行节约,并节约水电。应特别注意保持药品和试剂的纯净,严防混杂、乱用和污染。使用和洗涤仪器应小心仔细,防止损坏,贵重仪器使用前应熟悉使用方法,严格遵守操作规程,严禁随意开动,发现故障后应立即报告指导教师,不要自己动手检修,如有损坏按学校规定赔偿。 5、安全: 注意人身和国家财产安全是至关重要的,要时刻注意防火、防水、防电、防危险品、防事故,以免发生意外。实验室内严禁吸烟。使用乙醚、苯、乙醇、丙酮等易燃品时,不允许在电炉、酒精灯上直接加热。实验中须远离火源,如有危险发生,应首先关掉电源;有机溶剂着火时,勿用水泼,以免扩大燃烧面积,可用沙土、灭火器具灭之。用火时必须严格做到:火着人在,人走火灭。用毕电器后及时切断电源。加热试剂、液体时,管口不要对人,要十分小心操作,避免灼伤人。实验室内一切物品未经本室负责教师批准,严禁携带出室外,有毒物品尤其如此。借物必须办理登记手续。 生物化学实验技术概述 一、 层析法 层析是利用混合物各组分物理化学性质(如:溶解度、吸附能力、电荷和分子量等)的差别,使各组分在支持物上集中分布在不同区域,借此将各组分分离。 层析系统分为两个相:固定相和流动相。由于各组分受固定相的阻力和受流动相的推力影响不同,各组分移动速度也各异,从而使各组分得以分离。此法首先用于有色物质的分离,故又称色层析法。 层析法是近代生物化学最常用的分析法之一,此法可以分离性质极为相似、而用一般化学方法难以分离的各种化合物,如各种氨基酸、核苷酸、糖、蛋白质等。 层析法有多种类型,根据所用两组分不同分为以下几类:吸附层析、分配层析、离子交换层析、凝胶层析和亲和层析等;根据操作方式不同分为:柱层析、薄层层析和纸层析等。 (一) 吸附层析法: 吸附层析法(absorption chromatography)是混合物随流动相通过吸附剂时,由于吸附剂对不同物质有不同的吸附力而使混合物分离的方法。吸附层析根据操作方式的不同,分为柱层析与薄层层析两种。 1、柱层析法:柱层析法是用一根玻璃管柱,下端铺垫棉花或玻璃棉,管内加吸附剂粉末,用一种溶剂润湿后,即成为吸附柱,如图1中的(1)。然后在柱顶部加入要分离的样品溶液,如图1中的(2)。假如样品内含两种成分A和B,则二者被吸附在柱上端,形成色圈,如图1中的(3)。样品溶液全部溶入吸附柱中之后,接着就加入合适的溶剂洗脱,如图6-0-1中的(4)。A与B就随着溶剂的向下流动而移动。最后分离情况如图1中的(5)所示。 图 6-0-1 二元混合物的柱层析示意图 在洗脱过程中,管内连续发生溶解、吸附、再溶解、再吸附的现象。例如,被吸附后的A粒子被溶解(解吸作用)随溶剂下移,但遇到新的吸附剂,又将A粒子吸附,随后,新溶剂又使A粒子溶解下移。由于溶剂与吸附剂对A与B的溶解力与吸附力不完全相同,A与B移动的速率也不同,经一定时间,如此反复地溶解与吸附,而形成两个环带,每一环带是一种纯物质。如A与B有颜色可看到色层;如样品无色,可用其它方法使之显色,为进一步鉴定,可将吸附柱从管中顶出来,用刀将各色层切开,然后分别洗脱,现在多采用溶剂洗脱法,即连续加入溶剂,连续分段收集洗脱剂,直到各成分顺序全部从柱中洗出为止。 最常用的吸附剂是硅胶和氧化铝。硅胶的吸附能力和含水量关系极大,硅胶吸水后,吸附能力下降,常用于分离非极性的和极性不强的有机物,如甘油脂、磷脂、胆固醇等

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