生物固氮作用的分子机理研究.doc

项目名称： 生物固氮作用的分子机理研究 王忆平 北京大学 2010年1月-2014年8月 教育部 分离和鉴定参与信号传递的基因，建立根瘤菌与主植物共生关系蛋白相互作用网络LysR、GntR胞外多糖合成基因表达调节的双组分调控系统??因子、DNA折叠蛋白等）；线粒体呼吸耗氧与固氮酶厌氧的关系和影响；线粒体与细胞质之间的氨基酸穿梭往返机制对生物固氮效果的影响等。以上研究是固氮基因向真核生物转移的新的尝试，为非豆科植物（包括粮食作物）建立自主的生物固氮体系探索新路。 （3） 联合固氮作用有三个重要的限制因子，即氧、铵和能量。其中，能量和铵又是导致目前田间联合固氮效率低下的最主要限制因子。我们拟利用功能基因组操作平台，对斯氏假单胞菌和巴西固氮螺菌等联合固氮菌和上述主要限制因子，在联合固氮微生物功能基因组、联合固氮基因表达调节以及固氮酶催化机制等开展工作。分析鉴定可能参与细菌氮信号传导、调控或保持最佳固氮水平的新基因和新机制，系统研究联合固氮体系形成的分子机理和联合固氮微生物对土壤环境变化的适应能力, 探讨提高作物与固氮微生物之间的联合固氮效率的策略。 （4）N2的络合和还原 二、预期目标 总体目标： 本项目的总体目标是借助分子生物学和现代生物技术，开展生物固氮作用的分子机理研究，在分子水平上解析低等固氮微生物与高等植物宿主之间遗传信息的交流；共生固氮体系的建立；固氮过程中能量及营养物质的交换；固氮功能的发挥等关键科学问题。为扩大根瘤菌宿主植物范围、提高生物固氮效率，探索非豆科植物共生体系及自主固氮的可能性提供科学依据，为生物固氮在农业生产中的应用提供理论基础和技术支撑，缓解和减轻农业生产中长期和大量依赖工业氮肥施用所造成的能源和环境问题，为保障我国粮食生产安全，农业可持续发展提供新的途径。 五年目标： 1）建立根瘤菌与宿主植物共生关系中蛋白相互作用网络，分离和鉴定参与根瘤形成和发育功能基因及其调控蛋白，阐明根瘤菌共生信号在豆科植物中接受、传递及其调控的机制；建立豆科植物突变体库，分离和鉴定与共生固氮相关的突变株；比较豆科植物与根瘤菌或AM真菌共生基因的异同，并比较非豆科植物基因组，阐明非豆科植物中存在哪些与共生固氮相关的基因及其功能、表达与调控机制。 2）通过基因芯片等转录组学方法，分离和鉴定LysR和GntR家族转录因子调节的下游靶基因，阐明其调节共生固氮作用的分子机理；通过定向缺失突变，分离和鉴定参与根瘤菌细胞周期调控以及共生固氮作用的激酶和反应蛋白基因，并确定其相互作用网络；分离和鉴定参与共生固氮作用的功能基因和调节蛋白，阐明根瘤菌共生固氮基因表达调控的网络，根瘤菌识别、传递环境和植物信号，调节自身基因表达的分子机理。 3）在结构层面和基因组水平揭示固氮及氮代谢基因调控机理，与碳代谢系统及其基因的调控偶联机制，为提高固氮效率奠定理论基础；在结构层面上解析根瘤菌共生固氮的唯一碳源（能量）供应系统（Dct）的信号转导原理及其调控机制，为提高共生固氮效率奠定理论基础；构建单细胞真核生物--酵母菌的线粒体遗传操作系统，探索固氮基因簇向真核生物转化和表达的机制，为固氮基因向高等植物转移，建立非豆科植物（包括粮食作物）自主固氮体系的奠定基础。 开展联合固氮微生物比较基因组、生物固氮体系的进化、不同条件下联合固氮微生物基因表达谱的研究，揭示生物固氮进化途径的形成和机制，分析鉴定可能参与细菌氮信号转导或保持最佳固氮水平的新基因；系统研究联合固氮体系形成的分子机理，建立稳定的联合固氮体系，为提高作物与固氮微生物之间的固氮效率提出新策略； 分析P-cluster和FeMoco之间α螺旋上单个氨基酸替换后固氮酶结构的变化和可能对电子质子传递的影响，对固氮酶MoFe蛋白α亚单位中FeMo辅因子周围多肽环境中保守氨基酸定位诱变并构建不同的突变株，明确FeMoco的Fe2和Fe6是否是氮的络合和还原位置，及用于氮和质子还原的电子质子传递通道。? 分离和鉴定100个左右在共生固氮系统中参与根瘤形成和发育、共生固氮作用的功能基因和调节蛋白、根瘤菌细胞周期调控、LysR和GntR家族调控子（regulon）的新基因；分离和鉴定30-50个与共生固氮相关的突变体；20个联合固氮系统中参与细菌氮信号转导或保持最佳固氮水平的新基因；在影响因子2以上的国际刊物上发表论文80篇或达到相应的影响因子总数的文章数目。申请国内外发明专利10个以上。在生物固氮研究领域造就一支高水平的研究队伍，培养博士研究生60名以上。 三、研究方案 1）学术思路： 我们的学术思路和技术途经是围绕着生物固氮菌氮碳代谢基因表达调控偶联机理、豆科植物与根瘤菌相互作用机理、根瘤菌固氮系统调控机理和固氮菌固氮基因网络调控与固氮酶催化机制等核心课题，依据多学科（生物学