生物工程下游技术纳豆激酶提取实验.doc

《生物工程下游技术》综合实验 ——纳豆激酶的分离纯化 摘 要 从纳豆发酵液中提取纳豆激酶，采用30~70%饱和度的硫酸铵盐析，Sephadex G-75凝胶过滤层析对活性组分进行分离提纯。然后检测各个步骤的样品的蛋白质含量，绘制凝胶层析图，得出峰值，最后对整个纯化方案进行评价。结果表明，本次实验纯化回收率较低。 凝胶层析是生物化学中一种常用的分离手段，它具有设备简单、操作方便、样品回收率高、试验重复性好、特别是不改变样品生物学活性等优点，被广泛用于蛋白质(包括酶)、核酸、多糖等生物分子的分离纯化。凝胶层析是依据分子大小这一物理性质进行分离纯化的，透明质酸(hyaluronicacid，简称HA)，是一种国际上公认的生物大分子保湿剂，分子量达几十万到几百万，而蛋白质的分子量仅为几万，所以选择合适的凝胶可以起到分离纯化的效果。 关键词：纳豆激酶 硫酸铵盐析 凝胶层析 目录 1 前言 4 2 材料和仪器 4 2.1 仪器 4 2.2 材料 4 2.3 试剂及溶液配制 4 3 实验方法 5 3.1 纳豆的制作 5 3.2 纳豆激酶的粗提 5 3.2.1 浸提 5 3.2.2 硫酸铵盐析 5 3.3 Sephadex G-75凝胶层析进行纯化 6 3.4 蛋白质含量的测定 7 4 结果与分析 7 4.1 蛋白质含量测定结果 7 4.2 层析收集液测定结果 7 4.2.2 绘制纳豆激酶的层析图 8 4.2.3 纯化方案进行评价 9 5 讨论 9 5.1方法分析 9 5.2 问题及其猜想 10 参考文献 12 1 前言 心脑血管疾病是危害人类健康的严重疾病，其死亡率已超过了癌症。而血栓又是心脑血管疾病中致死率最高的疾病之一，虽然现在临床上有许多用于治疗血栓的药物,如链激酶、尿激酶、组织纤维蛋白溶酶原激活剂以及蛇毒栓溶剂等,但是它们大多为注射用药,使用不便,且副作用大、半衰期短,很难满足血栓治疗的需要。 纳豆激酶是日本的传统食品——纳豆(natto)在发酵过程中产生的，是一种由纳豆芽孢杆菌(Bacillusnatto)产生的具有纤溶活性的丝氨酸蛋白酶，该酶不但具有明显的溶栓活性，而且还可以激活体内的纤溶酶原，增加内源性溶纤酶的含量，具有降血压、抗氧化、抗肿瘤及溶血栓等医疗功效；且与传统的溶栓制剂相比，纳豆激酶有不易引起出血、无抗原性、半衰期长、安全无毒且成本低廉和能口服吸收溶栓等优点，因而具有广阔的开发前景，可能成为新一代的溶栓药物。自1987年Dr．Sumi首次从日本传统发酵食品纳豆中发现并可分离出纳豆激酶以来，该酶便受到世界相关研究人员的广泛关注。 凝胶层析收集洗脱液，经紫外分光光度计测定A280nm光吸收值，并绘制层析图谱。当出现第二个峰值过后即为实验终止，分析峰值数据，并以此对纳豆激酶纯化方案进行评价。 2 材料和仪器 2.1 仪器 紫外分光光度计，冷冻离心机，层析柱，离心管等。 2.2 材料 葡聚糖凝胶(Sephadex G-75) 2.3 试剂及溶液配制 2.3.1硫酸铵饱和溶液 400g硫酸铵溶于预热的70～80℃ 500mL 蒸馏水中，搅拌2h左右，冷却至室温至底部有结晶析出，NH4OH调pH7.8。 2.3.2 0.2mol/L，pH7.4磷酸盐缓冲液(PB) 0.2 mol/L NaH2PO4 19ml 0.2 mol/L Na2HPO4 81ml 2.3.3 0.01 mol/L，pH7.4磷酸盐缓冲生理盐水（PBS） 0.2mol/LPB 50mL NaCl 8.5—9g 加蒸馏水至1000mL 3 实验方法 3.1 纳豆的制作 将实验室保存的纳豆菌种接入斜面培养基，经37℃、24h活化培养。挑取一环活化的菌种接种于营养肉汤中，37℃、120rpm过夜作为种子培养液。 纳豆制作：大豆→ 清洗、浸泡→ 高压蒸煮（121℃，30min）→ 摊凉→ 接种（5％）→ 发酵（37℃、24h ）→ 后熟（4℃、过夜 ）→ 成熟纳豆 3.2 纳豆激酶的粗提 3.2.1 浸提 取固体发酵新鲜纳豆，加入2倍体积的灭菌生理盐水，搅拌，浸提24h以上，浸提液7000r/min，冷冻离心15min，取上清液即为粗提液。 3.2.2 硫酸铵盐析 取28ml的纳豆激酶粗提液，一边搅拌纳豆激酶粗提液，一边加入12ml的硫酸铵饱和溶液，采用30％饱和度的硫酸铵进行盐析，放置1h后，7000r/min离心10min，弃去沉淀，得到37ml的上清液，取36ml的