生物样品分析前处理技术.doc

生物样品分析前处理技术 生物样品的前处理涉及很多方面，但主要应考虑生物样品的种类，被测定药物的性质和测定方法三个方面的问题。 样品的分离、纯化技术应该依据生物样品的类型。例如，血浆或血清需除蛋白，使药物从蛋白结合物中释出；唾液样品则主要采用离心沉淀除去粘蛋白；尿液样品常采用酸或酶水解使药物从缀合物中释出，当原型药物排泄在尿中时，可简单地用水稀释一定倍数后进行测定。 根据被测定药物的结构、理化及药理性质、存在形式、浓度范围等，采取相应的前处理方法。例如，药物的酸碱性（pka）、溶解性质涉及到药物的提取手段；是否具有挥发性涉及到能否采用气相色谱法测定；药物的光谱特性及官能团性质涉及到分析仪器的选择、能否制成衍生物及应用特殊检测器的可能性。药物在样品中的浓度相差很大，浓度大的样品，对前处理要求可稍低；浓度越低则样品前处理要求越高。此外，药物在体内常产生许多代谢产物，其中一些代谢物仍具有药理活性，需要与原型药分别测定，因而也要了解药物的药理学性质和药物动力学特性。 样品于测定前是否需要纯化以及纯化到什么程度均与其后采用的测定方法的不同而不同。即纯化程度与所用测定方法的专属性、分离能力、检测系统对不纯样品污染的耐受程度等密切相关。一般说来，放射免疫测定法由于具有较高的灵敏度和选择性，因此当初步除去主要干扰物质之后即可直接测定微量样品；而对灵敏度和专属性较差的紫外分光光度法，分离要求就要相应高一些；至于常用的高效液相色谱法，为防止蛋白质等杂质沉积在色谱柱上，上柱前需对生物样品进行去蛋白，有时对被测组分进行提取、制备衍生物等前处理。下图大致反映了检测方法与样品前处理要求的相三关系。 样品处理步骤与分析方法的选择—(一）去除蛋白质 在测定血样时，首先应去除蛋白质。去除蛋白质可使结合型的药物均出来，以便测定药物的总浓度；去除蛋白质也可预防提取过程中蛋白质发泡，减少乳化的形成，以及可以保护仪器性能（如保护HPLC柱不被沾污），延长使用期限。去除蛋白法有以下几种。 1.加入与水相混溶的有机溶剂 加入水溶性的有机溶剂；可使蛋白质的分子内及分子间的氢键发生变化而使蛋白质凝聚，使与蛋白质结合的药物释放出来。常用的水溶性有机溶剂有：乙腈、甲醇、乙醇、丙醇、丙酮、四氢呋喃等。含药物的血浆或血清与水溶性有机溶剂的体积比为1：（1～3）时，就可以将90％以上的蛋白质除去。水溶性有机溶剂的种类不同时，析出的蛋白质形状亦不同；并且所得上清液的pH值也稍有差别，如用乙腈或甲醇时，上清液pH为8.5～9.5，用乙醇或丙酮时，上清液pH为9～10。操作时，将水溶性有机溶剂与血浆或血清按一定比例混合后离心分离，取上清液作为样品。通常分离血浆或血清用的离心机（3000r/min）不能将蛋白质沉淀完全，而采用超速离心机（10000r／min）离心1～2min便可将析出的蛋白质完全沉淀。离心时应用超速离心机专用的具塞塑料尖底管，可使析出的蛋白质牢固地粘在管底，便于上清液的吸取。 2.加入中性盐 加入中性盐，使溶液的离子强度发生变化。中性盐能将与蛋白质水合的水置换出来，从而使蛋白质脱水而沉淀。常用的中性盐有：饱和硫酸铵、硫酸钠、镁盐、磷酸盐及枸橼酸盐等。操作时，如按血清与饱和硫酸铵的比例为1：2，混合，离心（10000r/min）1～2min，即可除去90％以上的蛋白质。所得上清液的pH为7.0～7.7这种利用盐析的方法与有机溶剂提取法并用时，药物的回收率高，因而常常被采用。 3.加入强酸 当pH低于蛋白质的等电点时，蛋白质以阳离子形式存在。此时加入强酸，可与蛋白质阳离子形成不溶住盐而沉淀。常用的强酸有：10％三氯醋酸、6％高氯酸、硫酸-钨酸混合液及5％偏磷酸等。含药物血清与强酸的比例为1：0.6混合，离心〈10000r／min）1～2min，就可以除去90％以上的蛋白质。取上清液作为样品。因加入了强酸，上清液呈酸性（pH0～4），在酸性下分解的药物不宜用本法除蛋白。过量的三氯醋酸可经煮沸，分解为氯仿和二氧化碳而被除去；也有用乙醚提取过量三氯醋酸的方法。过量的高氯酸可用碳酸钾、醋酸钾、氢氧化钠等中和，然后加乙醇使产生的高氯酸钾（钠）沉淀而被除去。偏磷酸及硫酸-钨酸可用同法除去。 4.加入含锌盐及铜盐的沉淀剂 当pH高于蛋白质的等电点时，金属阳离子与蛋白质分子中带阴电荷的羧基形成不溶性盐而沉淀。常用的沉淀剂有CuSO4-NaWO4、ZnSO4-NaOH等。离心分离后所得的上清液pH分别为5.7～7.3和6.5～7.5。 5.酶解法 在测定一些酸不稳定及蛋白结合牢的药物时，常需用酶解法。最常用的酶是蛋白水解酶中的枯草菌溶素。它不仅可使组织酶，并可使药物析出。枯草菌溶素是一种细菌性碱性蛋白分解酶，可在较宽的pH活圈（PH7