用BRET方法研究活细胞中GPCR蛋白相互作用的基本注意事项.doc

用BRET方法研究活细胞中GPCR蛋白相互作用的基本注意事项 K. M. Kroeger1, K. A. Eidne1, Bernd Hutter2 简介： BRET已经成功的应用于研究哺乳动物细胞中GPCR同源和异源二聚体以及涉及到受 体脱敏作用和交易的受体/β-arrestin相互作用（综述，1）。BRET的显著优势是可以在活细胞中，正确的的位置实时的监测蛋白质和蛋白质之间的 相互作用。由于GPCR高度的疏水性和细胞本地化，测量蛋白质之间相互作用的常规技术（如：免疫共沉淀和酵母2杂交筛选）具有重大的缺陷。BRET是一个 简单的，快速均一法，可以克服这些限制。对7TM受体是一个普遍的过程。这个方法可以作为研究非依赖于他们信号通路的几乎所有7TM受体的筛选方法。 BRET原理 BRET是一种自然发生的现象，举个例子：在水母和海蜇中发生的水母素和GFP之间 发生的非放射性能量转移。可以通过标记了生物发光供体如：海肾的荧光素酶（Rluc）或者荧光受体如：增强型绿色或者黄色荧光蛋白（EGFP或EYFP） 的融合蛋白来研究BRET的相互作用。 当相互作用的部分在细胞内共表达，在底物腔肠素存在的情况下，当蛋白质距离足够近（在100?内）， 将发生能量从Rluc到EYFP的能量转移，发出发射光（2）。依靠于供体和受体分子的严格的距离使BRET成为研究涉及到所有GPCR功能和通过激动剂 和拮抗剂的调节的受体蛋白相互作用的理想工具。相似的，涉及到荧光供体和受体分子之间的能量转移的FRET技术，也代表了一种检测GPCR蛋白相互作用， 并且已经和成像技术结合在空间和时间上检测GPCR的相互作用的工具。不像FRET,它衍生出来的BRET不需要激发光，从而避免了自发荧光，漂白和细胞 的损坏的相关问题。因此，低背景荧光的BRET技术在检测低水平或者较弱的蛋白质相互作用时候非常灵敏（3）。FRET代表了一种检测GPCR蛋白相互作 用的，并且已经和成像技术结合在空间和时间上检测GPCR的相互作用的工具。通过单细胞BRET成像来确定蛋白质之间相互作用的细胞定位来显示在研究蛋白 质相互作用的中的重大进步。 BRET应用 为了应用BRET技术来研究受体的相互作用，细胞 中融合蛋白的共表达，如果这两个融合分子之间的距离足够近，那么光将从Rluc转移到EYFP.这个激发光，引起发射一个波长为530nm的发射光。 BRET被定量为在相同情况下，530nm和480nm的发光比率。最初BRET是在大肠杆菌中研究光敏生物钟蛋白的相互作用（2），其他几个组现在使用 BRET技术来研究哺乳动物细胞中GPCR蛋白的相互作用，包括受体同源二倍体（4-9）和异源二倍体（10-13）。GPCR和细胞内蛋白的相互作用要 求也要使用BRET技术检测受体功能，如：涉及到受体脱敏作用和内在化的受体/β-arrestin的相互作用。因此，理论上，BRET也是研究针对 GPCR功能的配体结合受体信号到脱敏作用，交易的受体相互作用的复杂实验的一种强大的工具。 Mithras LB940 Mithras LB940是一款多功能酶标仪。独立光路系统（DOPS-Dedicated Optical Path System）保证了检测技术要求的最优化表现。他们的功能有发光，BRET，荧光（顶读和底读），光吸收，荧光偏振和AlphaScreen?.另外， 提供选配件如：试剂进样器，温度控制和冷PMT检测模块。 图2：独立光路系统和Mithras LB940 方法： 使用BRET方法研究一个潜在的蛋白质和蛋白质之间的相互作用涉及到几个步骤 （1）产生两种感兴趣基因的蛋白质，他们的一个N和C末端分别和Rluc和EYFP融合。（2）在哺乳动物中共表达两种BRET融合蛋白。（3）检测 BRET信号。这种方法可以应用于研究哺乳动物细胞中任何蛋白质和蛋白质之间的相互作用。并且对于涉及到GPCRs的相互作用研究页没有限制。 BRET融合结构的生产 构成编码BRET融合蛋白包括以下内容： 1. 表达Rluc-EYFP融合蛋白的BRET融合结构的阳性对照（见注2）。 2. BRET结构的阴性对照：如：单独表达Rluc和EYFP的pRluc, pEYFP，GPCRs对照（非感兴趣的GPCR）和其他融合了Rluc或者EYFP的蛋白，（见注3）。在我们的研究中，我们利用促性腺激素释放激素（GnRH）促甲状腺激素释放激素（TRH）和β2肾上腺素受体，他们都是C末端和Rluc和EYFP结合（见注3）。 3. 首个感兴趣的蛋白的BRET供体结构，（C末端（GPCR/Rluc）或者N末端（Rluc/GPCR）标记为Rluc的GPCR的表达）（见注4-6）。 4. 第二个感兴趣的蛋白的BRET受体结构（C末端