用PEG8000大量制备和纯化质粒的方法(实验室版).doc

PEG8000沉淀法大量制备和纯化腺病毒质粒 1．取经小提质粒鉴定正确后的菌液于LB平皿上进行四区连续划线（划二区时，接种针无需烧灼处理），37℃培养过夜。挑取1个单菌落接种到500 ml 含特定抗生素的LB培养液内（可用1000ml三角烧瓶），于37℃，250~300 rpm震摇过夜。 2．收集500 ml菌液至干净的离心管，离心，5000 rpm，20 min (肉眼观察上清液，应澄清、透明)。 3．弃上清，在洗水纸上扣干。先后加入溶液Ⅰ10 ml （用洗管将细菌充分悬起、混匀）, 溶液Ⅱ20 ml（上下颠倒混匀20次、室稳静置5 min）和溶液Ⅲ 15 ml（上下颠倒混匀20次）。离心，5000 rpm，15 min。 4．转移上清至干净的50 ml离心管（如果膜状物质比较松散，可以用parafilm进行简单过滤处理），加入0.6倍体积的异丙醇（27 ml），充分混匀。离心，4000 rpm，15 min。 5．弃上清，用3 ml TE (1mM EDTA, 10 mM Tris-HCl, pH8.0)充分溶解所有沉淀（用吸管操作），加入等体积5 M LiCl（此时总体积为6 ml），混匀（此时溶液呈白色浑浊状），离心，4000 rpm，15 min。 6．转移上清（6 ml）至50 ml干净的离心管，加入0.6倍体积的异丙醇（3.6 ml），混匀。离心，4000 rpm，15 min。 7．弃上清，用0.5 ml TE 充分溶解沉淀（首先应确定沉淀的位置。分两步溶解，先加300 (l充分溶解并转移DNA后，再用200 (l溶解剩余沉淀并转移。溶解时，最好使用吸管），并将溶液转移至1.5 ml Ep管（此时溶液为无色、稍粘稠液体），加入5 (l RNaseA，37℃ 1 hr。加入等体积的1.6 M NaCl 含13% PEG 8000，倒置混匀数次，可观察到白色絮状沉淀。4℃离心，13 krpm，10 min。 8．弃上清，加入0.5 ml TE 溶解Ep管底部的白色沉淀。将沉淀轻轻弹起，55℃，1 hr或更长时间。期间倒置数次以促进DNA溶解（Ep管盖受热后极易弹开，要小心操作，或者用胶带将Ep管盖固定）。DNA充分溶解后，溶液为无色粘稠液体。 9．先后用酚和氯仿两步抽提DNA。酚、氯仿抽提是纯化DNA的重要步骤，关系到DNA的质量，应仔细操作。首先加入等体积酚（取酚时，应注意避开水相），剧烈倒置混匀数次，13 krpm，8 min，用200 (l移液器转移含DNA的上层水相到一新的Ep管中，避免吸到酚层液体。加入等量氯仿，剧烈倒置混允数次，13 krpm，8 min，移液器转移含DNA的上层水相到一新的Ep管中，避免吸到氯仿层液体。 10．直接加入100%乙醇，倒置混匀数次（可见到明显的絮状沉淀），10 krpm，5min离心（肉眼观察，在Ep管底部有白色或无色透明的DNA沉淀，有时沉淀也会出现在管壁上。），小心弃取上清，37℃，干燥30 min。 10．用500 (l TE，充分溶解DNA（无色、透明物质）。55℃，30 min，并用移液器反复吹吸数次直至完全溶解（估计可获得至少40~300 (g 质粒）。 备注： 1．溶液配制：（其作用是溶解细菌） 溶液Ⅰ：配制10( 贮存液，置4℃或-20℃保存； 溶液Ⅱ：使用前配制。为使溶液Ⅱ的配制更加方便，NaOH和SDS贮存液的浓度可分别为4N和20%。使用时，均进行20(稀释。（NaOH和SDS的终浓度分别为0.2N和1%，溶液Ⅱ作用是裂解细胞壁，） 溶液Ⅲ ：可大量配制，置室温保存，其中醋酸钾可与冰醋酸同时配制，醋酸钾的终浓度为3 M。要使用玻璃器皿贮存。 2．方法中观察到的一些现象，如100%乙醇沉淀时，出现絮状沉淀现象，仅见于分子量较大的腺病毒质粒。分子量较小的质粒，出现乳糜状沉淀。 3．获得质粒后，应通过检测OD260值，获得质粒浓度。 4．该法可制备各种大小质粒（~40 kb）。其纯度和CsCl梯度离心法近似。可满足各种转染的需求。 溶液I，50 mM葡萄糖 / 25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA，pH 8.0；溶液II，0.2 N NaOH / 1% SDS；溶液III，3 M 醋酸钾 / 2 M 醋酸。  溶液I的作用。适当浓度的和适当pH值的Tris-Cl溶液是用于控制好溶液的pH。加了葡萄糖后最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，配在分子生物学试剂中的主要作用是：抑制DNase的活性，和抑制微生物生长。在溶液I中加入高达 10 mM 的EDTA，无非就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉。 溶液II。这是用新鲜的0.4 N的N