用于定量分析分子动力学和分子相互作用的双光子萤光相干光谱学.doc

用于定量分析分子動力學和分子相互作用的雙光子螢光相干光譜學 Keith M. Berland* Physics Department, Emory University Atlanta, GA 30322-2430 Uir: 摘　要 由于螢光光譜學的多用途和高靈敏度,它越來越廣泛地被應用于生物學和生物物理學的研究。在合適的條件下，螢光光譜學測量可以準確地提供生物系統的物理化學和動力學特性。本文介紹了螢光光譜學的基本概念和理論，同時敘述了如何利用雙光子自動相干和雙光子雙色交叉相干螢光光譜測量分子動力學和分子的相互作用。應用實例包括定量分析蛋白質－蛋白質的相互作用，分子擴散的細胞外和細胞內測定，定量分析特定核酸的雜交反應。 本研究由Emory University Research Fund資助。 1. 引言 為了理解生物系統的生物和物理機制，定量分析生物分子的相互作用和相關的動力學是十分重要的，定量分析提供了一種重要手段去認識分子的結構，動態和功能。自從Magde等[1]首先將螢光相干光譜學(fluorescence correlation spectroscopy)應用于生物物理學測量后，螢光相干光譜學在這十年中已發展成為一種強有力的研究工具，它能定性和定量地分析生物分子的相互作用，化學反應，流體動力學和光物理特性等[2, 3]。由于實驗儀器的發展，共聚焦(confocal)和雙光子顯微(two-photon microscopy)可方便地檢測單個分子的螢光[4－6]，因此螢光相干光譜法的優點也越來越明顯。在各種螢光光譜法應用中，利用共聚焦或雙光子螢光顯微的微小的觀測體積(10-18 m3)特性來監測螢光信號隨時間變化的波動(functuation)是最常見的手段[2, 7]。很多因素可導致這種自發性平衡波動，如擴散(分子流出/流入觀測體)，化學反應及光物理作用等。對于稀釋濃度(10-9 M)的樣品，觀測體積內任何時候的分子總數都很小(1-1000)，確保了相對于平均螢光信號的信號波動的獲得。從螢光信號的振幅和時間相干特性中可獲得許多有用的參數，如擴散系數和樣品中各種分子之間的連接特性等[8-10]。用螢光相干光譜法測量分子間相互作用的一大優勢在于，它是直接測量獨立的分子而不是間接測定分子間相互作用。因此，在用螢光相干光譜法測量相互作用時，不存在對相互作用分子重量的限制。共聚焦和雙光子螢光顯微鏡對各種螢光相干光譜法使用均十分有用。本文重點介紹雙光子螢光相干光譜學，雙光子螢光激發在生物學上的應用有著顯著的優勢[11-13]。如文中所討論的，雙光子螢光激發對雙色交叉相干(dual-color cross-correlation)測量特別有利。 2.理論 2.1概論 對于一種特定的分子，由雙光子激發所產生的螢光信號(F)隨激發信號強度的平方變化，如下式所示： (1) 其中：(為入射光強，C為濃度，(為雙光子交叉截面，(為螢光量子產率，(為測量效率，S為激光空間分佈，尖括號為對時間的平均*。Veff表示測定體積，可由對S的積分得到。N為激發(測量)體積內的獨立分子的平均數。(表示分子的螢光亮度(光子/分子/秒)，它由分子的內在特性((, ()和測量系統相關參數((, ()決定，是確定螢光相干光譜法測試精度的最關鍵參數之一[14]。 在波動光譜學中，人們對映像測量中所見到的螢光強度隨時間變化的波動感興趣。以下給出了雙通道測量(dual-channel detection)的公式: 　(2) 因系統中不同種類分子的存在，用表示測量器通道 n (如紅 或 綠測量通道)的總波動信號，表示不同分子的濃度在空間分佈的波動。為n測量通道中i種分子的亮度。螢光相干函數定義如下： 自動相干： 　　(3) 交叉相干： 　　(4) 利用適當的代入，相干函數的公式可演繹為： 　 (5) 對于自動相干測量，m和n相等。對交叉相干，m和 n則代表不同的測量通道。前置常數 ( 取決于激發光源的空間分佈，參數Ai表示每種分子如何影響相干函數的 *如是脈沖激光(高斯脈沖)，P：平均功率，fp：循環率，(：脈沖寬度。 隨時間變化特性，這些參數取決于波動信號的來源。在交叉相干測量時，只有 (i,m 和 (i,n 值同時不為零時才對式5有貢獻，所以多色探測方法能夠在複雜的異性樣品中有選擇性地測量那些特定的分子。 當所有分子的亮度參數均相同(()時，式5可以簡化為以下的形式(式6)。 (6) 顯然它和單一分子的相干函數相同，所以時間為零時的振幅仍和總的分子數成反比，這也體現了螢光相干光譜測量的計量(counting)特性。 要進一步推導相干函數，必須知道螢光波動的耒源和激發光源