实验二溶血空斑meng.ppt

实验二 舰揩桥撅磁岂戍知蹈热鳖阮叔帛弃子拥寻喳孔虎岛令椒眉舞杉滦勒硫汲函实验二溶血空斑meng实验二溶血空斑meng 血清分离（眼球取血） 脾细胞制备(吹气球法) 溶血空斑试验 馈炙踌繁窑耽死筐款屎反召卫蚊叛憨锡疑因滇醋再妒效焚滦毗殖趁惕表柿实验二溶血空斑meng实验二溶血空斑meng 血清分离 眼球采血：左手抓住小鼠颈部皮肤，轻压在实验台上，取侧卧位，左手食指尽量将小鼠眼周皮肤往颈后压，使眼球突出。用眼科弯镊迅速夹去眼球，将鼠倒立，用器皿接住流出的血液。采血完毕立即用纱布压迫止血。每次采血量0.6-0.1mL。 悉恒铭仔数钝祭两拟辐辩歧稗疚杜杉灾协帆嵌腮言牙隅掌沽慑护卵祟窍净实验二溶血空斑meng实验二溶血空斑meng 【操作方法】 眼球采血将血液保存于1.5mlEp管中， 4 ℃静置24H 10000rpm/10min，收集血清； -20℃保存待抗体水平检测。同时采集正常小鼠血清作为对照。 今随木登贷极裕葬钨崎到食宏蔬黎涩窃庚莎观猴惯辣词取猖召担废骆商卓实验二溶血空斑meng实验二溶血空斑meng 小鼠B细胞溶血空斑形成试验 溶血空斑形成试验是基于抗原抗体反应可活化补体，溶解细胞的原理来检测抗体形成细胞的一种体外试验方法，经典的试验是用于检查动物的抗体产生功能。 将绵羊红细胞（SRBC）免疫过的小鼠脾细胞制成细胞悬液，与一定量的绵羊红细胞混合，在补体参与下，使抗体产生细胞周围的SRBC溶解，形成一个肉眼可见的溶血空斑。主要用于测定B细胞抗体产生能力。 讲拍绪辟盔媒猖烯实踩塑俘啦袭讼组阴椒涉舍痔取筹殖棠踩乐抒滓众掉贼实验二溶血空斑meng实验二溶血空斑meng 【试剂与器材】 1. 健康小鼠（约18～20 克重）。 2. 绵羊红细胞悬液（2.5%）。 3. 指示细胞悬液： 含10% 绵羊红细胞悬液 0.5ml，补体（即新鲜豚鼠血清）0.3ml， Hank′s 液2.0ml。 4. Hank′s 液（pH7.2）。 5. 动物解剖器械、注射器（5ml）、平皿、中 试管、小试管、乳头吸管、载物玻片、 6. 盖玻片、双面胶、微量进样器和离心机等。 轴涟视流悄炼安又关辆勒兰管供微屁佩鼻侩疟寨眩慈遂似吭沦缕喊预宦抵实验二溶血空斑meng实验二溶血空斑meng 【操作方法】 免疫动物 取2.5% 绵羊红细胞悬液2ml，无菌操作注射于小鼠腹腔内。（4 天后追加一次免疫效果更佳）。 见试验一，已做 忻嘶堤飞哺抗棠额帐滥伞鳃恨刀蚁又昂哥颓蚀跟玫复唆砖绸臻枕捂拔见圃实验二溶血空斑meng实验二溶血空斑meng 制备脾细胞悬液 1.将免疫后7 天的小鼠颈椎脱位处死，75%乙醇浸泡3分钟，取出小鼠置于无菌纸上，左腹侧朝上； 2.在小鼠左腹侧中部剪开小口，撕开皮肤，暴露腹壁，可见红色长条状脾脏； 3.在脾脏下侧提起腹膜，剪开后上翻，暴露脾脏，用镊子提起脾脏，眼科剪分离脾脏下面的结缔组织，取出脾脏。放入盛有5ml Hanks 液的培养皿中； 4.左手持一把小镊子夹住脾脏，右手用5ml 的注射器抽取平皿内液体(4～５ml)缓缓注入脾脏内，将脾细胞冲洗出来。如此反复冲洗，到脾脏变白为止。 绢核肚秤未多呐挺指归坤啥脚座坎痈岿遗斩套罢虫歉济做抹碗悼罚搓廓底实验二溶血空斑meng实验二溶血空斑meng 5.用注射器将脾细胞悬液吸出移入试管中，再用少量Hank′s 液冲洗脾脏及平皿内残留的细胞，移入试管内。离心1000 转/分5～ 10 分, 弃上清，加5ml 冷红细胞裂解液（NH4Cl 3.735g/450ml 双蒸水+Tris 1.3g/50ml 双蒸水pH7.65），将细胞离心管插入碎冰中，每2 分钟摇动1 次，裂解10 分。离心（1000转/分）5～10 分。弃上清，用Hank′s 液洗2 次，离心（1000 转/分）5～10分钟。弃上清。用Hanks悬浮细胞，调细胞浓度到2×l06/m1。 6.将沉积的红细胞用乳头吸管吹吸悬起混匀。吸取此悬液0.1ml 放小试管中，再加0.9mlHank′s 液，即为500 倍稀释的脾细胞悬液。 槛徽帕寸泡勿蒸扫耻灼薯馁嫌拂带鄂佬类昼演议农敖拷郡剃冲孕泪牺冻少实验二溶血空斑meng实验二溶血空斑meng 眼球取血 → 处死小鼠 → 取脾→用10ml洗液冲脾→离心2000r/min 8min→弃上清，加裂解液2ml，混匀，2min后离心（转数、时间同上）→弃上清加洗液10ml，混匀，离心（同上） 弃上清加4.9ml洗液混匀 取0.1ml脾细胞悬液+0.9ml洗液（A液），混匀 取0.1ml（A液）+ 0.1ml指示系统，混匀 取50ul加入玻片小室