石河子部分猪场链球菌2型的分离鉴定与毒力因子检测.doc

石河子部分猪场链球菌2型的分离鉴定与毒力因子检测 霍永，李劼，张银国* (新疆石河子大学动物科技学院，石河子市　832003) 摘要：为了解石河子垦区具有呼吸道病症状的病死猪感染猪链球菌2型的情况，对采集的53份肺脏组织进行了猪链球菌的分离培养、生化鉴定、PCR鉴定以及cps2J、ef、mrp毒力因子的检测。结果：分离出猪链球菌2型21株；其中8株毒力因子为cps2J，10株毒力因子为ef，3毒力因子为cps2J/ef；小鼠试验表明：cps2J毒力因子的菌株不具有致病性，毒力因子为ef、cps2J/ef的菌株具有致病性。结论：石河子部分规模猪场存在链球菌2型感染情况，且部分感染菌株具有致病性，应引起有关生猪养殖场的高度重视。 关键词：猪链球菌2型；分离鉴定；毒力因子 猪链球菌2型(Streptococcus suis， SS2)是一种严重危害养猪业的重要病原之一，能引起猪的关节炎、脑膜炎、胸膜肺炎、败血症、脓肿等，并且猪链球菌2型能引起人感染发病，是重要人畜共患病病原[1]，从事屠宰或与生猪肉打交道的人易通过伤口感染，引致人脑膜炎、败血症、心内膜炎、并可致死。 5%血清的Todd-Hewitt肉汤(THB)，含5%血清的选择性THB，普通琼脂绵羊血平板，选择性普通琼脂绵羊血平板；小白鼠由石河子大学实验动物中心提供。10×Buffer、25 mmol/L MgCl2、2.5 mmol/L dNTPs、2.5UTaq酶（北京诺维森生物科技有限公司），Marker1、Marker2000(广东东盛生物科技有限公司)。 PCR阳性对照：上海海利生物药品有限公司链球菌病灭活疫苗（马链球菌兽疫亚种+猪链球菌2型）。 PCR扩增仪、电泳仪、凝胶成像系统均为Bio-Rad公司产品。 1.1.3引物合成 猪链球菌2型荚膜多糖基因(cps2J)、溶菌酶释放蛋白基因(mrp)、胞外因子(ef)的引物参照文献[3]由上海生工生物工程有限公司合成。各序列见表1： 表1 PCR引物、退火温度及目的片段大小 目的基因 引物序列 退火温度/时间 产物大小 ef P1 5-ACA AAG GCG TAG GTT CAA TC-3 55℃/30s 269bp P2 5-CGG CAT CAA GAA TGT CTT TG-3 cps2J P1 5-GTT GAG TCC TTA TAC ACC TGT T-3 55℃/30s 450bp P2 5-CAG AAA ATT CAT ATT GTC CAC C-3 mrp P1 5-GGTATACCT TGC TGG TAC CGT TC-3 60℃/30s 532bp P2 5-AGT CTC TAC AGC TGT AGC TGG-3 1.2方法 1.2.1细菌的分离鉴定 参照文献[4]，在无菌条件下，采集病死猪肺脏，革兰染色，镜检，将有G+双球菌或短链状的球菌病肺划线接种于普通琼脂绵羊血平板，37℃培养24h～36h；挑取平板上单个可疑菌落涂片，革兰染色后镜检，将镜检中发现的G+短链状球菌的单个菌落接种于选择性THB中，37℃培养24h，将菌液接种于选择性普通琼脂绵羊血平板，37℃培养24h，挑取平板上单个可疑菌落涂片，革兰染色后镜检，对G+链球菌菌落做过氧化氢酶试验，阴性者初步确定为猪链球菌2型分离株，将分离株菌落接种于含5%血清THB培养基中，37℃培养24h，接种于灭菌甘油-生理盐水中，-20℃冰箱保存备用。 1.2.2细菌的生化鉴定 将分离的纯培养菌株分别接种于含5%血清THB培养基中，37℃培养24h后，接种于5%乳糖、蔗糖、葡萄糖、D-核糖、甘露醇、山梨醇生化培养基中，每菌各接种2管，培养24h后观察并记录结果。 1.2.3PCR扩增及电泳鉴定 模板制备　 取经THB培养的菌液1mL，疫苗取0.5mL，12000r离心10min，弃上清，沉淀用300μL TE洗涤2次，弃上清，沉淀加100μL无菌去离子水，在沸水浴中煮沸10min，12 000r离心10min收集上清为模板，置-20℃备用。 反应体系与反应条件 反应体系(25μL)：10×Buffer 2. 5μL、25 mmol/L MgCl21. 5μL、2.5 mmol/L dNTPs2. 0μL，10μmol/L上、下游引物各1.0μL，模版5.0μL，灭菌ddH2O 11.5μL，2.5 U Taq酶0.5μL。 反应条件：预变性95℃5min，变性94℃40s，退火温度与时间见表1，延伸72℃30s，共30个循环，最后72℃延伸10min。取扩增产物8μL在1.5%琼脂糖凝胶中，以电压130V电泳30min，凝胶成像仪获取结果。 1.2.3 动物试验 挑选30只健康小白鼠，试验前观察2