人鼻咽癌转移相关基因的克隆及其功能初步鉴定.ppt

人鼻咽癌转移相关基因的 克隆及其功能初步鉴定 陆元志 2001-01-03 立题依据 1、鼻咽癌为具有中国特色 的恶性肿瘤，转移早。 2、肿瘤转移分子机制研究新 进展。 3、HGP进入后基因组时代 带来新的机遇。 4、新技术的应用。 研究思路 高、低转移 癌细胞cDNA 表型克隆技术 SSH 相关基因EST Northern blot 生物信息学分析 全长cDNA钓取 基因转染 原位杂交 蛋白表达 抗体获得 研究目标 1、克隆鼻咽癌转移相关新基因 2、构建鼻咽癌转移相关新基因 的cDNA文库 3、初步明确新基因的结构和功能 4、证实新基因在鼻咽癌组织中的 表达情况，明确新基因与鼻咽 癌转移的关系 研究内容： 1、SSH技术分离高、低转移能力 不同的鼻咽癌细胞株的差异 表达基因 2、T/A克隆法构建差异表达基因 的cDNA文库 3、应用生物信息学方法与技术分 析差异表达基因的结构及定位 并预测新基因的功能 4、检测新基因在鼻咽癌组织中 的表达水平，明确新基因与 鼻咽癌转移的关系 5、采用RACE技术钓取新基因的 全长cDNA 6、基因转染及动物实验进一步 观察所获取新基因的功能 拟解决的关键问题 1、鼻咽癌差异表达基因的克隆。 2、构建新基因的cDNA文库。 3、新基因功能的分析与预测。 4、全长cDNA的钓取。 研究方法： mRNA提取 抑制消减杂交（SSH） Northern blot PCR产物 T/A克隆 生物信息学方法与技术 RACE技术 基因转染 裸鼠实验 技术路线（包括实验方案） 一、应用SSH分离高、低转移癌细胞 差异表达基因 高转移株(tester) 低转移株(driver) cDNA合成 cDNA合成 Rsa I 酶切 Rsa I 酶切 接头-1和接头-2 杂交削减 PCR 二、构建差异表达基因cDNA文库 PCR产物插入T/A克隆载体， 转化细菌、挑选阳性克隆 质粒扩增、DNA提取 酶切鉴定 PCR鉴定 Northern blot 检测 三、生物信息学方法与技术分析 大量扩增cDNA文库质粒 DNA测序 通过Internet登录GeneBank BLAST程序作同源分析、 染色体定位、表达谱分析等 编码序列分析 四、检测新基因在鼻咽癌活检 组织中的表达水平 鼻咽癌活检标本(转移与非转移) 提取总/mRNA Northern blot、 RT-PCR 对照分析 五、采用RACE技术钓取新基因 的全长cDNA 提取总RNA/mRNA cDNA合成 5’RACE cDNA 5’RACE PCR Full-length cDNA 重组新基因质粒 转染低转移能力/非转移 鼻咽癌细胞株 筛选阳性表达细胞 体外增殖、 裸鼠体内 侵袭能力 生长与转 检测 移特性观察 六、基因转染与动物实验