自噬双标腺病毒(mRFPGFPLC3)使用指南1404.doc

自噬双标腺病毒（mRFP-GFP-LC3）使用指南 背景： 自噬是细胞内的一种“自食（Self-eating）”的现象，凋亡是“自杀（Self-killing）”的现象，二者共用相同的刺激因素和调节蛋白，但是诱发阈值和门槛不同，如何转换和协调目前还不清楚. 自噬是指膜（目前来源还有争议，大部分表现为双层膜，有时多层或单层）包裹部分胞质和细胞内需降解的细胞器、蛋白质等形成自噬体，最后与溶酶体融合形成自噬溶酶体，降解其所包裹的内容物，以实现细胞稳态和细胞器的更新mRFP-GFP-LC3腺病毒的操作 收到病毒后的处理 （一）、腺病毒的储存 1、病毒采用运输收到病毒液后若用于实验，可分装部分于4保存（一周内用完）避免反复冻融，否则会降低病毒滴度每次冻融会降低病毒滴度10%。建议不要在-20下长期保存。如果病毒储存时间超过6个月，应该重新病毒滴度。 （二）、腺病毒的稀释 需要稀释病毒时，将病毒取出后置于冰上融解，使用培养目的细胞用PBS或培养基稀释到所需浓度后混匀分装后4保存，并尽快用于实验（一周内用完），动物实验建议使用注射用平衡液来稀释，并尽快用完。 培养皿 表面积 对应细胞培养液体积 病毒感染对应细胞培养液体积 类型 /cm2 96-well 0.3cm2 100ul 50ul 24-well 2cm2 500ul 250ul 12-well 4cm2 1ml 500ul 6-well 10cm2 2ml 1ml 60mm 20cm2 4ml 2ml 100mm 60cm2 10ml 5ml 感染2小时后直接换液 II、悬浮细胞 上面介绍的是针对贴壁细胞的感染方法，若是悬浮或半悬浮细胞，则需要通过平角离心转染法，即将适量的病毒液加入细胞培养皿后，封好口，放入平角离心机后，低速离心1h，然后放入培养箱中正常培养即可。若由于实验条件有限，没有平角离心机，可用离心管代替，将细胞吹打吸入离心管中，进行低速离心，去掉大部分上清，然后加入适量的病毒液，室温放置10min（不能超过半小时），然后将细胞和病毒液同时吸出转入培养皿中继续病毒感染至2小时后换液即可。 （三）观察感染情况 感染24小时后，可以开始观察到GFP以及RFP表达，36-48小时可以进行细胞固定、封片（需要使用防淬灭的固定剂）、拍照分析。 （四）结果分析 mRFP-GFP-LC3串联荧光蛋白腺病毒中表达的GFP和mRFP用于标记及追踪LC3，GFP 的减弱可指示溶酶体与自噬小体的融合形成自噬溶酶体（由GFP荧光蛋白对酸性敏感，当自噬体与溶酶体融合后GFP 荧光发生淬灭,此时只能检测到红色荧光，原理如下图所示）。 。 。 统计方法 我们在显微镜成像后红绿荧光merge后通过merge后出现的黄色斑点即只是自噬体.红色的斑点指示自噬溶酶体,通过不同颜色斑点的计数可以清晰的看出自噬流的强弱:一般统计采用人为计数的方法，也就是统计叠加（overlay）之后黄色斑点和红色斑点的数目，然后做出bar图。 如下图:细胞转染mRFP-GFP-LC3病毒后给予氨基酸剥夺处理2 小时后出现明显增强的自噬以及自噬流（通过merge后的红色小点明显增多可以判定自噬流水平升高）。 Antioxid Redox Signal 14(11): 2179-2190. 实验操作注意事项 1、操作病毒时请尽量使用生物安全柜；? 2、操作时需戴上帽子，佩戴双层手套，双层口罩；? 3、病毒操作中绝对禁止在安全柜内有任何皮肤直接暴露的情况； 4、剩余的病毒和接种用的注射器等耗材需高压灭菌后才能扔弃； 5、操作完毕要及时用肥皂和水洗手消毒； 6、未尽事宜请咨询汉恒生物技术人员了解详情，汉恒生物全国免费热线400-092-0065观看腺病毒实验操作视频，并与我们的客服人员互动交流。 参考文献： Hariharan, N., et al. (2011). Oxidative stress stimulates autophagic flux during ischemia/reperfusion. Antioxid Redox Signal 14(11): 2179-2190. Ma, X., et al. (2012). Impaired autophagosome clearance contributes to cardiomyocyte death in ischemia/reperfusion injury. Circulation 125(25): 31