草菇纤维素酶活测定实验方案(终).doc

第三章 草菇纤维素酶活性测定 3.1 草菇菌丝培养 3.1.1 培养基类型： A: 固体平板培养基：PDA B: 液体培养基：基础培养基+2%葡萄糖 C: 种子培养基：基础培养基+1%甘油 D: 诱导产酶培养基：基础培养基+1%诱导物 基础培养基basal medium（g/L）： KH2PO4 1.0、 K2HPO4 0.4、 MgSO4·7H2O 0.5、 CaCl2·2 H2O 0.013、 Yeast extract 0.1、 L-asparagine 1.5、 NH4NO3 0.5、 thiamine·HCl 0.0025 (sterilized by filtration and added after autoclaving of other medium components)、Tween 80 0.2% ( vol/vol )、 Mineral solution 0.1%；终pH用2 M KOH调至6.2，高压灭菌15-20min。 配置： 0.25g溶于100 ml水中，配成2.5 mg／ml的Thiamine·HCI溶液，过滤除菌。每个液体诱导培养三角瓶加0.1ml。 配置： Mineral solution (g/L)：柠檬酸铁FeC6H5O7 4.8、 ZnSO4·7H2O 2.64、 MnCl2·4H2O 2.0、 氯化钴CoCl2·6H2O 0.4、 and CuSO4·5H2O 0.4。 配置100 ml。 3.1.2 诱导物类型： 诱导物： a: 羧甲基纤维素钠(cabroxymethylcellulose) CMC 1% b: 纤维二糖cellobiose C.bi 2% c: α-乳糖α-lactose α-L 0.5% d: 微晶纤维素Microcrystalline cellulose M.C 1% e: 定量滤纸Filter paper F.P 1% 3.1.3 草菇诱导产酶培养 将PYD15、PYD21、H1521用薄的PDA固体平板培养。32℃下培养7d。 接种到加葡萄糖的基础培养基中， 32℃，150 rpm振荡培养7d。 取相同体积的菌丝接种到甘油培养基中， 32℃，150 rpm振荡饥饿培养48h。 将相同容积的菌丝体接种到D诱导产酶培养基中。32℃，150 rpm液体振荡培养48 h。同时收集三个样品菌液和菌丝。并将菌丝放入液氮中保存备用。 技术路线如下： 药品配置： DNS试剂(GB)：称取 3,5-二硝基水杨酸(10.0) g，置于约600 mL水中，逐渐加入氢氧化钠10 g，在50℃水浴中(磁力)搅拌溶解，再依次加入酒石酸甲钠200 g、苯酚(重蒸) 2 g和无水亚硫酸钠5 g，待全部溶解并澄清后，冷却至室温，用水定容至1000 mL，过滤。贮存于棕色试剂瓶中，于暗处放置7d后使用。 DNS试剂（Y.H.Percival Zhang）：称取 DNS 10.6 g，NaOH 19.8 g完全溶于1,416 mL水中。再依次加入酒石酸甲钠360 g、7.6 ml融化的苯酚(50℃)和8.3 g焦亚硫酸钠。贮存于棕色试剂瓶中，于暗处放置7d后使用。 磷酸缓冲液(GB)：0.1 mol/L pH6.0 (适用于中性纤维素酶) 分别称取一水磷酸二氢钠121.0g和二水磷酸氢二钠21.89 g，将其溶解在10 L去离子水中。调节溶液的pH到6.0备用。溶液在室温下可保存一个月。 磷酸缓冲液(实际配制)： A：0.2 mol/L磷酸氢二钠：称取磷酸氢二钠-十二水71.64g，定容至1000ml。 B：0.2 mol/L磷酸二氢钠：称取磷酸二氢钠-二水31.21g，定容至1000ml。 A液：12.3；B液：87.7。配成0.2M的母液，加1倍水即为0.1M缓冲液。 葡萄糖标准贮备溶液制备（10 mg/ml）： 称取于(103±2)℃下烘干至恒重的无水葡萄糖1g ,精确至0.1mg，用水溶解并定容至100mL。 标准曲线的制备： 分光光度计、恒温水浴、计时器、沸水浴、试管架、20 ml具塞试管、擦镜纸、1 ml移液枪、枪头 葡萄糖标准使用溶液 分别吸取葡萄糖标准贮备溶液0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20、1. 50、2. 00、2. 50、3. 00、3. 50、4. 00 mL于50 ml离心管中，定容至10 mL，摇匀。 绘制标准曲线： 管号 葡萄糖标准使用液 缓冲液吸取量ml DNS吸取量m