荧光探针定量PCR技术原理及应用.docx

荧光探针定量PCR技术原理及应用 ?????PCR技术是通过对基因的选择性片段进行体外高效扩增，实现目的基因的检测。荧光探针定量PCR（FQ-PCR）是一种新的基因定量检测技术，国外文献多用“实时定量PCR（real time quantitative PCR）”或“TaqMan PCR(以美国PE公司商标命名) ”。该技术是在常规PCR基础上加入荧光标记探针，巧妙地把核酸扩增（PCR）、杂交及光谱技术结合在一起，从而实现了对目的基因的准确定量检测，正发展成为临床实验诊断的常规技术。1.原理 ?????FQ-PCR的工作原理[1-3]是利用Taq酶的5’ → 3’外切酶活性，在PCR反应系统中加入一个荧光标记的探针。该探针可与引物包含序列内的DNA模板发生特异性杂交，探针的5’端标以荧光报告基团FAM（6-羧基荧光素，荧光发射峰值在518mm处），靠近3’端标以荧光淬灭基团TAMRA(6-羧基四甲基诺丹明,荧光发射峰值在582nm处)，两者之间构成能量传递结构。当探针保持完整时，5’端荧光报告基团所激发出的荧光信号被3’端淬灭基因吸收或抑制，不出现荧光信号变化。当PCR反应体系中有目的基因存在，就会扩增出特异核酸片段，荧光探针即会根据碱基配对的原理与之杂交。当PCR进入延伸（复制）期，Tap酶从引物3’端开始,随新链延伸沿DNA模板移动，当移动到探针结合的位置时，其5’→ 3’端外切酶活性作用，将探针切断（切口平移效应）。荧光报告基团和淬灭基团间的能量传递结构被破坏，淬灭基团的淬灭作用被解除，荧光报告基团的荧光信号释放出来（图1）。PCR反应每复制一个特异核酸片段，就有一个探针被切断，伴随一个荧光信号的释放。由于被释放的荧光基团数目和PRC产物是一对一的关系，因此用荧光检测技术检测出的荧光信号有无或强弱，即代表扩增产物有无或多少。由于荧光信号是代表扩增产物的有效特异信号，无需进行有效和无效信号分离，实现了仪器实时检测(图2)，为新的PCR定量原理创造了条件。图1.TaqMan PCR反应模式 （A）聚合反应：（B）链置换；（C）裂解； （D）聚合完成（R：FAM；Q：TAMRA；FP：上游引物；RP：下游引物） 图2.FQ-PCR实时动力学曲线?????ABI公司首先根据上述原理研制了ABI 7700 等系列定量PCR仪，在PCR反应中设置标准模板系列（一般5~7个标准浓度）反应管和空白对照管。通过实时检测反应管中的荧光信号，计算出RQ+、RQ-、△RQ。RQ+代表样品管荧光报告基团发光强度与淬灭基团发光强度的比率，RQ-代表空白管中二者的比率，△RQ（△RQ = RQ+-RQ-）代表PCR过程中荧光信号变化量。当荧光信号增强到某一阈值（根据荧光信号基线的平均值和标准差，计算出以99.7%的置信度大于平均值作为阈值）时，标准模板反应管所用的循环次数（Ct值）就被记录下来。Ct值与标准模板数量的对数值之间有严格的线性关系[3]，利用系列标准模板的Ct值，制成标准曲线(图3)，根据待测样品的Ct值，就可在标准曲线中确定待测样品起始的DNA数量。根据数据处理，即可得出定量结果。探针设计一般应符合以下条件[2]：①探针长度应在20~40个碱基左右，以保证结合的特异性。②GC碱基含量在40%~60%，避免单核苷酸序列的重复。③避免与引物发生杂交或重叠。④探针与模板结合的稳定程度要大于引物与模板结合的稳定程度，因此探针的Tm值要比引物的Tm值至少高出5℃。另外，探针的浓度，探针与模板序列的同源性，探针与引物的距离都对实验结果有影响。图3.FQ-PCR 标准曲线 2. 技术特点2.1 封闭状态下检测，避免了扩增产物污染而致的假阳性 ?????传统PCR于反应结束后取出反应液，通过电泳染色和紫外仪观察结果。扩增产物在开放状态下分析，对实险室的污染是不可避免的。因污染而导致假阳性，成为PCR临床实验诊断技术应用一个难以逾越的障碍。FQ-PCR在全封闭状态下实现PCR扩增和产物分析，完全杜绝了扩增产物污染而导致的假阳性。至于样品间的污染，无论从目的基因的数量、浓度还是颗粒大小分析，都比较容易控制。我国PCR临床应用出现问题，产物污染所致假阳性是主要原因之一。 2.2 基因的定量检测，扩展了临床应用空间?????传统PCR对基因的检测只能定性，不能定量主要是由扩增产物积累的动力学所决定的：①PCR产物在扩增过程中呈指数积累，当产物增加到一定程度，产物就停止了指数积累。不同起始模板，其指数增长期所用的循环是不同的，因此，不同数量基因的样品在同一循环次数中积累的产物不能作为样品基因定量的依据；②PCR产物积累到一定程度就不能再增加，再进入平台期。为了扩大PCR检出的灵敏度通常要增加循环次数，循环次数增加使得样品目的基因含量高的反应管已进入平台期，终产物