荧光素酶及其报告基因的应用和检测.docx

荧光素酶及其报告基因的应用和检测一生物发光生物发光（bioluminescence）是指生物体发光或生物体提取物在实验室中发光的现象。它不依赖于有机体对光的吸收，而是一种特殊类型的化学发光，化学能转变为光能的效率几乎为100%。也是氧化发光的一种。生物发光的一般机制是：由细胞合成的化学物质，在一种特殊酶的作用下，使化学能转化为光能。与荧光的区别在于荧光：荧光检测需要激发光源，发射光的能量来源于激发光，荧光反应为瞬时反应。发光：生物发光、化学发光，发光反应无需激发光源，发射光的能量来源于化学反应，发光有一定的持续时间。二荧光素酶荧光素酶（Luciferase）是生物体内催化荧光素(luciferin)或脂肪醛(firefly aldehyde)氧化发光的一类酶的总称,来自于自然界能够发光的生物。自然界存在的荧光素酶来自萤火虫、发光细菌、发光海星、发光节虫、发光鱼、发光甲虫等。细菌荧光素酶对热敏感,因此在哺乳细胞的应用中受到限制。目前,以北美萤火虫虫(Photinus pyralis)来源的荧光素酶基因应用的最为广泛,该基因可编码550个氨基酸的荧光素酶蛋白，是一个61kDa的单体酶，无需表达后修饰，直接具有完全酶活。发光机制生物荧光实质是一种化学荧光。萤火虫荧光素酶在Mg2+、ATP、O2的参与下,催化D2荧光素(D2luciferin) 氧化脱羧,产生激活态的氧化荧光素,并放出光子,产生550～580 nm 的荧光,其化学反应式如下。这种无需激发光就可发出偏红色的生物荧光,其组织穿透能力明显强于绿色荧光蛋白( GFP) 。荧光素酶是靠酶和底物的相互反应发光,特异性很强,灵敏度高,由于没有激发光的非特异性干扰, 信噪比也比较高。三荧光素酶报告基因报告基因（reportgene）是一种易于检测蛋白质或酶等表达产物的基因，可通过报告基因产物的表达来“报告”目的基因的表达调控。通常把报告基因的编码序列和基因表达调节序列融合形成嵌合基因,或与其他目的基因融合,在调控序列控制下进行表达,通过报告基因的表达产物来标定目的基因的表达状况。1 常见的报告基因：β‐半乳糖苷酶（β‐Gal）葡萄糖醛酸酶（GUS）绿色荧光蛋白（GFP）分泌型碱性磷酸酶（SEAP）荧光素酶（LUC）2 报告基因简单实验流程构建包含有报告基因的质粒将构建好的质粒转染细胞提供相应的刺激（诱导）检测报告基因数据分析3 荧光素酶作为报告基因的优势：内源性低，哺乳动物无内源性表达荧光素酶检测不受细胞内其他物质影响发光检测，检测方便灵敏度高，10‐20摩尔荧光素酶分子检测范围广，大于7个数量级4 其它报告基因正因为荧光素酶与底物的结合特异性很强，检出的灵敏度高，没有激发光的非特异性干扰，信噪比较高，具有其他报告基因不可替代的优势，它作为报告基因显示出良好的前景。荧光素酶已成为医学研究领域的重要工具,在基因工程研究中被广泛作为报告基因用于单个细胞、转基因生物、动物和人体基因表达的实时、低光成像,是一种非常实用的研究方法，对于推动基因工程研究的发展具有重要作用。四它的检测方法依赖生物发光特性,利用闪烁计数器( scintillationcounter) 对荧光素酶的活性作出定量检测。在标准反应条件下,加入超量底物,经一定时间内,荧光闪烁总数与样品中存在荧光素酶的活性成正比。另外,也可以采用光自显影法对荧光素酶进行定性检测。五利用MicroChemi检测植物叶片中的荧光素酶生物发光1 打开MicroChemi相机开始制冷2将植物叶片喷加发光底物（喷底物的过程需遮光）3 将样品置入MicroChemi暗室室温孵育10min（孵育时间随样品而定）4 打开MicroChemi软件，设置拍摄参数5利用binning3x3，每10分钟曝光一次，共曝光三张6添加伪彩，调节照片的对比度，得到最佳照片附：利用MicroChemi2.0检测烟草叶片中荧光素酶的发光，曝光10min，binning3x3