虫草抗氧化分析.doc

冬虫夏草菌丝体水提物抗氧化和保护氧化损伤活性研究 罗建光1 杨晓彤1* 杨庆尧1,2 糜可1 冯慧琴1 (1上海师范大学生命与环境科学学院微生物与免疫学研究所,上海，200234 2上海杨杨百草研究所, 上海，200234) 摘要：目的：研究冬虫夏草（Cordyceps sinesis）菌丝体热水提物(CS-HWE)抗氧化活性及体外氧化损伤保护作用。方法：采用铁离子还原法（FRAP）和H2O2氧化损伤的PC12细胞模型对CS-HWE抗氧化活性及对氧化损伤保护活性分别进行了测定。结果：样品抗氧化活性为158.03±5.39μmol Fe2+·g-1,相当于天然虫草提取物活性的75%。CS-HWE在50-100mg·L-1时可明显提高PC12细胞对H2O2氧化损伤的保护作用，活性与天然虫草提取物相当。结论：虫草菌丝体热水提物具有一定的抗氧化作用，可作为开发天然抗氧化药物的潜在资源。 关键词：冬虫夏草菌丝体；FRAP；PC12细胞；抗氧化 中图分类号：R282.71　　文章标识码：A　　文章编号： 自由基是一类具有不配对电子的活泼化学基团，其中氧自由基和氮氧自由基是与生命或健康相关的主要自由基类型。这些自由基可与许多生物大分子发生氧化损伤反应，目前认为衰老、炎症、癌症、白内障、心血管疾病、以及帕金森氏病、阿尔兹海默氏病等神经退行性疾病都与自由基氧化损伤有关[1]。抗氧化、减少过多的自由基产生，或促进机体产生内源性抗自由基物质、提高机体对自由基氧化损伤的自我保护能力，可在一定程度上预防相关疾病的发生或改善症候。因此，筛选和开发抗自由基物质受到医药界的广泛关注。 冬虫夏草（Cordyceps sinensis（Berk.）Sacc.） Hepialus armoricanus)幼虫上的子座及幼虫内菌核的复合体,为名贵的滋补性传统中药材。药理学研究表明，冬虫夏草及其发酵菌粉具有抗氧化的作用，并认为虫草的抗衰老活性与清除自由基能力有关 [2]。目前人们对冬虫夏草抗自由基活性的测定主要采用黄嘌呤氧化酶法、超氧化物岐化酶SOD、过氧化物酶POD、谷胱甘肽过氧化物酶GSH-PxMDA)等方法进行评价，但此类方法仅反映虫草对某类自由基（如氧自由基O2-· 、羟自由基OH-· 、脂质过氧化自由基ROO-·等）的清除作用，而不能反映总体抗氧化能力。因此，本研究首次采用可测定总抗氧化活性的铁离子还原法（ferric reducing antioxidant power assay，FRAPDulbeccos modified Eagles medium (DMEM，InvitrogenFBS，PAAMTT)与十二烷基硫酸钠(SDS)为Sigma产品、2，4，6—三吡啶三吖嗪（2,4,6-Tri(2- pyridyl)－s-triazine，TPTZ）Alfa Aesar公司产品，其它化学试剂均为国产分析纯。酶标仪(Bio-Rad680)，CO2 培养箱(Heraeus)，真空低温冷冻干燥机（Virtis 2KBTES-55），高速冷冻离心(Beckman GS-15R)，超净工作台，紫外-可见分光光度计（岛津UV-2450）、电子天平、PH计（PHS-3TC）。天然冬虫夏草为上海雷允上药业有限公司产品（产地为青海、西藏）。金水宝为江西金水宝制药有限公司国药准字鼠肾上腺嗜铬瘤PC12细胞株PC12生长并维持在含10%FBS、105 U·L-1 penicillin、1μg·L-1 streptomycin的DMEM培养基中，并置于37℃、5％CO2饱和湿度的培养箱培养。 1.1.3 样品制备 冬虫夏草(Cordyceps sinesis CS-1 菌株)经液体发酵培养所得菌丝体，用热水浸提、离心分离提取液、再经减压浓缩、冷冻干燥，得到虫草发酵菌丝体水提取物(CS-HWE)。各样品用磷酸缓冲生理溶液（PBS）配制成10mg/ml的贮备液，用0.22μm除菌并保藏在4℃冰箱中备用,临用前用DMEM完全培养基(C-DMEM)配制成所需实验浓度。天然冬虫夏草和金水宝均经与CS-HWE相同方法提取、干燥，分别得到天然冬虫夏草水提物（NCS）和金水宝水提物(JSB)，在实验中作为阳性对照。 1.2 方法 1.2.1 FRAP法测定虫草菌丝体水提物的抗氧化活性 其原理为Fe3＋三吡啶三吖嗪（TPTZ）可被样品中的还原物质还原为二价铁形式，呈现出蓝色，并于593nm处具有最大光吸收，根据吸光度的大小可计算出样品抗氧化活性的强弱。[4-5]：FRAP试剂用NaAc-HAc缓冲液（pH 3.6）、10mmol·L-1 TPTZ(用40mmol·L-1 HCl配制)、20mmol·L-1 FeCl3按体积比10：1：1取液（）200?l，加入