血吸虫研究新进展.doc

免疫胶体金技术诊断日本血吸虫病的研究进展 彭运潮1,2，胡述光3，刘增再2，林矫矫1 (1.中国农业科学院上海家畜寄生虫病研究所农业部动物寄生虫学重点开放实验室，上海 200232; 2.湖南农业大学动物科技学院,湖南长沙 410128;3.湖南生物机电职业技术学院,湖南长沙 410128) ?摘 要：血吸虫病是一种分布广泛、危害严重的人畜共患寄生虫病。近年来，日本血吸虫病在我国部分地区死灰复燃，造成具大的经济损失。国内外对该病的检测技术研究较多，目前，诊断日本血吸虫病的经典方法仍是病原学诊断。文章对胶体金标记技术的基本原理、免疫胶体金的制备方法及其在免疫诊断中的常见标记对象做了简要介绍，并对免疫胶体金技术诊断日本血吸虫病的研究状况进行了综述。 关键词：日本血吸虫病;胶体金;诊断 日本血吸虫病曾流行于我国南方12个省（市）、自治区，目前仍在108个县和57个县级农场流行，受威胁的人、畜各有近1亿(陈贤义等，2001)。20世纪80年代以来，血吸虫病防治策略由消灭媒介钉螺转向以化疗为主的综合性防治措施，由此血吸虫病的早期诊断工作愈显重要。家畜（特别是牛）是日本血吸虫的主要保虫宿主和感染者，其在血吸虫病的流行过程中起着重要的传播作用（郑江等，2000）。在血吸虫病的防治工作中，控制家畜感染源尤为重要，因而除了查治病人外，还必须对流行区的家畜进行查治。目前家畜日本血吸虫病的诊断方法主要是粪检法和ELISA法。粪检法费时费力，阳性检出率也较低，已不适合在现场广泛使用。ELISA法需要仪器设备，也不方便于现场使用。因此，寻找简便快速、准确灵敏，并具有考核疗效和防治效果以及监测疫情的家畜日本血吸虫病的诊断方法，已成为当前迫切需要解决的问题。 血清学诊断方法已在现场普遍应用，其中利用胶体金标记技术的免疫学方法是近年来新兴的一种简便快速的检测方法，已被广泛应用于多种寄生虫病及其它传染性疾病的诊断，如恶性疟疾（Craig M H等，1997）、囊虫病（McManus D P等，1995）、曼氏血吸虫病（Bosompe K M等，1996）、弓形虫病（郭兰英等，2000）、猪口蹄疫病（金颜辉等，2004）的诊断。 1 胶体金标记技术的基本原理 胶体金是利用氯金酸（HAuCl4）在还原剂如柠檬酸钠、鞣酸、抗坏血酸、白磷、硼氢化钠等［1］作用下，可聚合成一定大小的金颗粒，形成带负电的疏水胶溶液。由于静电作用而形成稳定的胶体状态，称胶体金。胶体金对蛋白质有很强的吸附功能，可以与葡萄球菌A蛋白、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素、激素、牛血清蛋白、多肽等非共价结合。因此，它可以作为探针进行细胞表面和细胞内生物大分子的精确定位，在基础研究和临床检验中得到广泛的应用。胶体金标记蛋白质的原理，一般认为是由于pH等于或稍偏碱于蛋白质等电点时，蛋白质呈电中性，此时蛋白质分子与胶体金颗粒相互间的静电作用较小，但蛋白质分子的表面张力却最大，处于一种微弱的水化状态，较易吸附于金颗粒的表面。由于蛋白质分子牢固地结合在金颗粒的表面，形成一个蛋白质层，阻止了胶体金颗粒的相互接触，而使胶体金处于稳定状态。胶体金具有很高的动力学稳定性，在稳定因素不受破坏时，其自身凝聚极慢，可放置数年。用还原法可以方便地从氯金酸制备各种不同粒径，也就是不同颜色的胶体金颗粒。 2 胶体金的制备方法 制备胶体金的还原剂有柠檬酸钠、柠檬酸、硼氢化钠、单宁酸、白磷、抗坏血酸等，其中最常用的为柠檬酸钠，而使用后三者能制备出较小的胶体金颗粒［2］。 2.1 柠檬酸钠还原法 在带有冷却管的锥形瓶内加入0.01%的氯金酸水溶液100 mL，加热至沸腾；迅速加入10 g/L柠檬酸钠水溶液4 mL，搅拌后再煮沸5 min。在此期间溶液由无色经浅蓝、蓝色至紫红色。 要获得不同大小的胶体金颗粒，可通过增减柠檬酸钠的用量来调节。柠檬酸钠的用量愈多，胶体金颗粒的直径愈小；柠檬酸钠的用量愈少，则胶体金颗粒直径愈大。大量研究证明用该法制备胶体金时金颗粒的大小是柠檬酸钠用量的函数。 2.2 柠檬酸钠改良法 用新鲜制备的多蒸水247.5 mL置于锥形瓶内煮沸，加入10 g/L柠檬酸钠15 mL，继续煮沸5 min，加速搅拌并迅速加入1%氯金酸2.5 mL，继续煮沸15 min，冷却，无菌密封保存。此法可制备直径8 nm~10 nm较均匀的胶体金颗粒，改变柠檬酸钠的用量可制备不同大小的金颗粒。 2.3 柠檬酸钠=鞣酸还原法 用此混合还原剂可以得到比较满意的金溶胶，而且制备程序简单、颗粒均匀一致。方法如下：取4 mL10 mL/L鞣酸，0 mL~5 mL 25 mmoL/L K2CO3(体积与鞣酸加入量相等)，以双蒸水补至溶液最终体积为20 mL，加热至60 ℃，取1 mL 1%的氯金酸，加于79 mL双蒸水中，水浴加热至6