血液细胞化学染色技术在血液病诊断中的应用.doc

血液细胞化学染色技术在血液病诊断中的应用 细胞化学(或组织化学)是组织学的一个分支，是在细胞形态学的基础上研究细胞的生物化学成分、定位、定量及代谢功能状态的学科。经典细胞化学从1830年问世以来已经逐步完善。本世纪50年代哺乳动物和人白细胞的过氧化酶、碱性磷酸酶、酯酶、溶酶体等染色技术相继出现，并不断完善。近代细胞化学则在此基础上，吸收并运用生物化学、免疫学、细胞生物学和分子生物学的基本原理与技术，从细胞分子水平研究细胞形态与功能的关系，发展了放射自显影、免疫荧光、免疫酶标等免疫组织化学新技术。对研究核蛋白的合成、细胞动力学、细胞胞浆和表面免疫球蛋白合成、细胞分化抗原表达及癌变研究发挥了巨大的作用。原位杂交细胞化学，通过染色体基因定位、核酸分子原位杂交、原位聚合酶链反应，洞察单个细胞内原癌基因的激活、扩增及表达变化等等，为探索癌变发生机制、肿瘤早期诊断、治疗、预后判断以及肿瘤防治展现美好前景。 急性白血病分型，形态学是基础，瑞氏染色准确率45.7%，细胞化学染色可将诊断提高到80%以上，国际上用MIC分型进一步提高了白血病的诊断率。而现国际上又提出WHO分型，对细胞化学提出更高要求。 一．髓过氧化物酶(myeloperoxidase，POX)染色 (一) 联苯胺染色法(Washburn) [原理] 粒细胞及分化较好的单核细胞胞质内颗粒中的过氧化物酶，分解过氧化氢后，释放初生态氧，使联苯胺氧化，氧化联苯胺与亚硝基铁氰化钠在细胞内结合,形成蓝色颗粒，经进一步氧化而成棕黑色，定位于胞质内。 [试剂配制] 1.0.3％复方联苯胺染液：联苯胺0.3g加入90％乙醇99m1中，再加入36％亚硝基铁氰化钠1m1，混匀。此染液在棕色瓶内可保存10个月。 2.过氧化氢溶液：3％过氧化氢溶液1滴加入蒸馏水5m1中，混匀。每次用前需新鲜配制。 [操作步骤] 1.在新鲜干燥的血或骨髓涂片上滴加0.3％复方联苯胺染液6～10滴，使之盖满涂膜，作用1分钟。 2.不将联苯胺倾去，即加等量的过氧化氢溶液，与上液充分混匀，作用4分钟。 3.自来水冲洗，晾干。 4.瑞氏染液复染(比常规瑞氏染色时间稍长)。 [结果判断] 阳性结果为胞质内出现蓝黑色颗粒。 [阳性程度参考标准]：(-)无蓝黑色颗粒；(±)颗粒细小，弥散分布；(+)颗粒较粗，局灶分布；(++)颗粒粗大密集，分布较广，约占胞质的l／2～2／3；(+++)颗粒粗大成团块，几乎布满胞质；(++++)颗粒成团块状，充满胞质，并覆盖胞核。 （二） 二氨基联苯胺染色（DAB染色法） 1985年国际血液学标准化委员会推荐方法之一。 [原理]细胞颗粒中的过氧化酶，能将过氧化氢中的氧释放出来，氧化二氨基联苯胺（DAB），形成金黄色沉淀而定位于过氧化酶活性的部位。 [试剂配制] 1.3%戊二醛60%丙酮固定液：60ml丙酮加入40ml蒸馏水中，再加入4.3ml 70%的戊二醛(或12ml 25%戊二醛)，保存于冰箱的冰盒内。 2.0.5M pH7.6 Tris-HCL缓冲液。 3.底物：3.3’-二氨基联苯胺。 4.稀释 H2O2。（现用现配）：50ml蒸馏水加2～3滴30% H2O2。 5.作用液：称取10mg3.3’-二氨基联苯胺放入三角烧瓶中，加入40mlTris-HCL缓冲液，充分混匀，用力振荡混合液2～3分钟，仍可能留有一些黑色颗粒,迅速过滤到棕色瓶中。 6.Maryer’s苏木素复染液：苏木素0.1g，加入蒸馏水100ml，加热溶解，再加入5g钾明矾与20mg碘酸钠搅动直到钾明矾溶解,加入5g水合氯醛和0.1g枸橼酸，混合后煮沸5分钟，冷却后过滤备用。 7.0.5%氨水。 [操作步骤] 1.涂片冷固定1分钟，蒸馏水冲洗，晾干。 2.滴加作用液将血膜盖满，均匀滴加等量稀释 H2O2，混匀，室温放置10分钟，水冲， 晾干。 3.Maryer’s苏木素复染5～10分钟，水冲，0.5%氨水返蓝，水冲，晾干。 4.镜检。 [结果判断] 阳性物为金黄色。 [阳性程度参考标准]：（-）胞浆内无阳性颗粒；（+）阳性物淡黄色弥散状分布胞浆，或阳性物颗粒粗大聚集，约占胞浆面积1/4；（++）阳性物黄色弥散状分布，有一定空隙，约占胞浆面积1/2；（+++）阳性物呈金黄色均匀分布于胞浆或阳性物聚集约占细胞浆面积3/4；（++++）阳性物呈棕黄色，充满整个胞浆没有空隙。 [阳性率及阳性指数计算法] 阳性率：计数100个幼稚细胞，观察其阳性细胞的个数，即为阳性率。 阳性指数：根据所观察不同阳性程度细胞个数乘以其阳性程度之和，即（+）×1 +（++）×2 +（+++）×3