血细胞测试方法.doc

血细胞测试方法(血细胞计数板)1 RBC测试方法 小鼠尾静脉取血20ul，吹入盛有3.98ml红细胞稀释液的试管内，充分混匀，显微镜下计数。将血细胞计数板5个中方格内的红细胞总数乘以10000，即得1mm3血液内的RBC数量。2 TWBC测试方法 取小鼠尾静脉血20ul，吹入盛有0.38ml白细胞稀释液的试管内，充分混匀，显微镜下计数。将血细胞计数板4个大方格内的白细胞总数乘以50，即得1mm3血液内的WBC数量。3 PC测试方法 取小鼠尾静脉血20ul，吹入盛有038ml血小板稀释液的试管内，充分混匀，显微镜下计数。将血细胞计数板5个中方格内的血小板总数乘以1000，即得1mm3血液内的PC数量。用自动血液分析仪应该是可以的，只是要注意采血过程中避免混入其它杂质及凝血，造成仪器堵孔！可以稀释，用生理盐水也可以用自动血液分析仪测定血细胞需要的最少容积是多少？这就要看你是什么样的仪器了，一般都在50uL以下，另外，抗凝可以考虑使用EDTA，用生理盐水应该不会影响到测定的稳定性，只是注意在测定前一定要混匀。一般医院都有用微量血的血液分析仪，只需要用毛细吸管是20uL血。只要注意将血打入时一定要充分和凝剂混匀，避免凝集。一般的医院可能用的是枸橼酸钠抗凝。你可以到医院检验科看一下，仪器是什么型号的的，现在用的什么抗凝剂并且加多少抗凝剂动物血液标本阻塞是标本采集质量问题，和动物本身的细胞没有关系。还有现在有成品的稀释液购买，很便宜的。采用预稀释模式，需要更少的血量，我们一般是采用20ul。测定 RBC ,WBC（TWBC） ,PLT( PC) 三个指标，如果用血液分析仪测定，一般100微升就可以了，也有一些仪器采用全自动进样方式可能标本量要多些，但是最好多一点，因为抗凝剂浓度过大对细胞有影响，推荐使用EDTA-K2，终浓度2-4mg/ml，我测过一些小鼠血常规，因为血难取，经常凝固，所以采血一定要顺利，可短尾取血，取血后迅速混匀。小鼠的各种细胞数都较高，而且白细胞体积较小。用血浆测肝生化指标，不会有影响，现在许多生化分析仪推荐使用肝素抗凝血。细胞计数：实验原理：当待测细胞悬液中细胞均匀分布时，通过测定一定体积悬液中的细胞的数目，即可换算出每毫升细胞悬液中细胞的细胞数目。具体操作： 一.准备工作： 取一瓶传代的细胞，按照《传代细胞培养（消化法）》中的传代方法繁殖细胞，待长成单层后以被使用。 二.细胞悬液制备： 细胞悬液的制备方法是用0.25％的胰蛋白酶液消化、PBS液洗涤后，加入培养液（或Hanks液或PBS等平衡盐溶液），吹打制成待测细胞悬液。1.盖好盖玻片：取一套血球计数板，将特制的盖玻片盖在血球计数槽上。 2.制备计数用的细胞悬液：用吸管吸5滴细胞悬液到一离心管中，加入5滴台盼蓝染液（0.4％）或苯胺黑，活细胞不会被染色，加入染液后就可以在显微镜下区别活细胞和死细胞。3.将细胞悬液滴入计数板：将待测细胞悬液吹均匀，然后吸取少量悬液沿盖片边缘缓缓滴入，要保证盖片下充满悬液，注意盖片下不要有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中。4.统计四个大格的细胞数：将血球计数板放于显微镜的低倍镜下观察，并移动计数板，当看到镜中出现计数方格后，数出四角的四个大铬（每个大格含有16个中铬）中没有被染液染上色的细胞数目。5.计算原细胞悬液的细胞数:按照下面公式计算细胞密度：（细胞悬液的细胞数）/ml＝ （ 四个大格子细胞数/4) ×2×104 说明：公式中除以4因为计数了4个大格的细胞数。公式中乘以2因为细胞悬液于染液是1：1稀释。 公式中乘以104因为计数板中每一个大格的体积为：1.0mm（长）×1.0mm（宽）×0.1mm（高）＝0.1mm3 而 1ml＝1000mm3四.细胞计数要点： 1.进行细胞计数时，要求悬液中细胞数目不低于104个/ml，如果细胞数目很少要进行离心再悬浮于少量培养液中；2.要求细胞悬液中的细胞分散良好，否则影响计数准确性。3.取样计数前，应充分混匀细胞悬液，尤其时多次取样计数时更要注意每次取样都要混匀，以求计数准确；4. 数细胞的原则是只数完整的细胞，若细胞聚集成团时，只按照一个细胞计算。如果细胞压在格线上时，则只计上线，不计下线，只计右线，不计左线。5. 操作时，注意盖片下不能有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中，否则要重新计数。五.易犯的错误： 1. 计数前未将待测悬液吹打均匀。 2. 滴入细胞悬液时盖玻片下出现气泡。 3. 滴入悬液时的量太多，至使细胞悬液流入旁边的槽中。 六.本实验特殊试剂的配制： 4％台盼蓝母液：称取4克台盼蓝，加入少量蒸馏水研磨，加双蒸水至100毫升，用滤纸过滤，4保存。使用液：使用时，用PBS稀释母液至0.4％即可。原理 培养的