观察鸡嗉囊中淋巴细胞的定位分布及数量变化.docx

　观察鸡嗉囊中淋巴细胞的定位分布及数量变化 随着鸡黏膜免疫研究的深入，鸡黏膜免疫组织学内容亦趋完善。大量研究表明，禽类肠相关淋巴组织由肠道中集合的淋巴组织和散在的淋巴细胞一起构成。前者包括食管扁桃体、幽门扁桃体、盲肠扁桃体等，后者则为分布在各肠段中的散在的淋巴细胞，其主要分布于消化道、前胃、回肠和直肠等组织中.嗉囊作为食物的最初储存场所，能使禽类摄取的食物保持适当的温度和湿度，并对其进行浸润与软化，利于胃肠道对食物进一步消化吸收。试验表明，切除嗉囊后鸡消化能力明显下降，并且更容易出现细菌感染等疾病，提示嗉囊对于食物中的微生物具有初步的抵御作用. 　　冯小刚等于 2013年通过免疫组织学方法发现鸡嗉囊中亦有大量的淋巴细胞分布，并将其归为肠相关淋巴组织中的重要组成部分。鉴于此，本试验对鸡嗉囊的淋巴细胞做进一步研究。旨在观察鸡嗉囊中淋巴细胞的定位分布及数量变化情况，探索嗉囊免疫基础的建立过程，从而为肠相关淋巴组织的完善增添新的内容，同时也为疫苗的研发和嗉囊疾病的治疗提供理论依据。 　　1 材料与方法　　　　1.1 试验样品　　将 100枚清洁级海蓝白种蛋进行孵化，鸡出壳后置于动物室中常规饲养。分别在出壳后 1、4、7、10、14、21、35及 56日取材。每次取 7只鸡新鲜嗉囊的相同部位，置于蛋白包埋液（OCT）中包埋后进行低温切片，片厚 5μm.-80℃超低温冰箱保存备用。 　　1.2 抗体　　试验所用单克隆抗体见表 1.【表1】　　　　1.3 试剂和仪器　　日本樱花蛋白包埋剂（OCT），AAF液，丙酮，伊红和 3-氨丙基 -3-乙氧基甲硅烷（APES）等。Lei-caCM1850冰冻切片机，UltraSensitiveTM SP超敏试剂盒 kit-9710（福州迈新公司），OlympusCX41显微镜，Image-proPlus5.1图像分析软件（美国 MediaCybernetics公司），Pixerapro150ES图像采集器。 　　1.4 试验方法　　取嗉囊切片，做以下处理：滴加过氧化物酶阻断溶液（试剂 A），室温下孵育 10min,以阻断内源性过氧化物酶的活性；PBS洗 3次，各 3min;滴加正常非免疫动物血清（试剂 B）封闭，室温下孵育 10min;滴加相应稀释单抗工作液 50μL,4℃条件过夜；PBS洗 3次，各 3min;滴加生物素标记的第二抗体（试剂C），室温孵育 10min;PBS洗 3次，各 3min;滴加链霉素抗生物素 -过氧化物酶溶液（试剂 D），室温下孵育 10min;PBS洗 3次，各 3min;DAB显色；苏木精复染；脱水；透明；镜检封片、照相。 　　1.5 图像分析及统计学处理　　对各抗体阳性细胞进行分析，并选择放大倍数为 100的图片，采用 Image-proPlus5、1图像分析软件对单位视野内的免疫组织化学阳性细胞的面积进行测定。对每个抗体对应的各个部位的切片随机选定 5个视野，然后求平均值。采用 SPSS19、0单因素方差分析进行统计分析。 　　2 结果与分析　　　　2.1 CD3+细胞的发育规律　　出壳后 1日龄时，可见少量 CD3+细胞分布于嗉囊黏膜固有层的小血管周围（图 1a）；4日龄时，CD3+细胞数量增多，散布于黏膜固有层与黏膜下层；7日龄时，首次观察到以 T细胞为中心的淋巴聚集物（图 1b），且有部分 CD3+细胞分布于沿黏膜上皮下区域；27日龄时，部分 CD3+细胞出现在腺体周围，并向腺体上皮突入；35日龄时，CD3+细胞出现在黏膜上皮中，形成嵌有淋巴细胞的黏膜上皮，同时，腺体与上皮间固有层中出现弥散的淋巴聚集物（图1c）。56日龄时，血管周围阳性细胞较少，但淋巴聚集物增多，黏液腺上皮受淋巴细胞浸润明显，且部分腺体上皮和黏膜上皮转化为淋巴上皮（图 1d）。 　　CD3+细胞于 1日龄时即出现，随后于 4日龄明显增多（P0、05），其后逐渐增多，并于 21日龄时再次明显增多（P0、05），随后 CD3+细胞增加缓慢，呈稳定水平（图 2）。 　　2.2 CD4+细胞的发育规律　　1日龄时，少量的 CD4+细胞出现在嗉囊固有层的血管周围（图 1e）；4日龄时，固有层中的 CD4+细胞数量明显增多；7日龄时，观察到 CD4+细胞出现在食管腺周围，并有向腺体内部突入趋势（同 CD3+细胞一样，首次观察到含 CD4+细胞的淋巴聚集物）；21日龄时，CD4+细胞于滤泡间区域聚集，并发生明显浸润至腺体的现象；35日龄时，分布于聚集物的CD4+细胞，一部分位于滤泡外区域，而另一部分依然位于聚集物中心（图 1f、1g）；56日龄时，部分CD4+细胞围绕在腺体周围，使部分腺体上皮转化为淋巴上皮（图 1h）。 　　CD4+细胞于 1日龄能够被观察到，4日龄时增加明显（P