论文题目小型猪牙齿相关干细胞介导的实验性牙周炎骨缺.doc

论文题目：小型猪牙齿相关干细胞介导的实验性牙周炎骨缺损修复及生物牙根再生体内实验研究 作者简介：刘怡，女， 1972年9月出生，2003年8月师从于首都医科大学口腔医学院王松灵教授，于2006年6月获博士学位 中 文 摘 要 牙周炎很常见，常引起牙周骨缺损，是导致牙齿缺失的主要原因之一。目前临床上牙周炎致骨缺损的治疗是一个难题。牙齿缺失也很常见，目前临床上均是赝复体修复，缺乏真正意义上的生物修复。牙齿相关干细胞及组织工程技术为新的生物性修复再生牙周组织及其牙齿提供了可能。本研究利用与人类牙颌系统相似的小型猪作为大型动物模型，首先分离培养小型猪牙周膜干细胞及根尖牙乳头干细胞，研究其生物学特性，并建立稳定可靠的牙周炎骨缺损模型，探讨牙周膜干细胞修复实验性牙周炎骨缺损的能力；同时利用牙周膜干细胞及根尖牙乳头干细胞复合生物支架材料进行生物牙根再生。本研究旨在为利用牙齿相关干细胞结合组织工程技术进行牙周再生修复及生物性牙齿再生修复提供大型动物的实验依据。本研究包括以下三部分。 第一部分 小型猪牙周膜干细胞及根尖牙乳头干细胞体外分离培养及生物学特性研究 目的：分离培养小型猪牙周膜干细胞及根尖牙乳头干细胞，研究其生物学特性，为利用干细胞进行牙周及牙根组织工程打下基础。方法：选取3只成年小型猪，无菌条件下拔除尖牙，剥离牙根外牙周组织及根尖牙乳头组织，参照以往关于人牙齿相关干细胞的培养方法及条件分离培养小型猪牙周膜干细胞及根尖牙乳头干细胞，并通过倒置显微镜、免疫组织化学、免疫荧光、流式细胞仪、透射电镜、扫描电镜等对其生长特性及在三维支架材料羟基磷灰石/磷酸三钙（HA/TCP）上的生长情况进行观察。结果：原代培养的小型猪牙周膜干细胞生长良好，呈多角形或梭性，克隆形成率为1～23个/105，根尖牙乳头干细胞克隆形成率为20～130个/105。免疫荧光结果表明，分离培养的第3代牙周膜干细胞中部分细胞Stro-1、Nestin及ALP表达阳性，流式细胞仪结果表明牙周膜干细胞Stro-1表达阳性率为5.6%，Nestin为12.5%， ALP为15.0%。根尖牙乳头干细胞中约有7.6%的细胞抗Stro-1抗体阳性。第2代牙周膜干细胞及根尖牙乳头干细胞的倍增时间最快，生长曲线呈“S”型。透射电镜下可见，第1～3代牙周膜干细胞及根尖牙乳头干细胞生长良好，胞浆内线粒体、高尔基体和粗面内质网丰富，随着培养时间的延长，分泌的细胞外基质增多。并且牙周膜干细胞分泌的胶原纤维比相同条件下培养的根尖牙乳头干细胞更多，更厚。扫描电镜观察结果表明，牙周膜干细胞及根尖牙乳头干细胞在HA/TCP三维支架上生长良好，充分伸展，并分泌大量细胞外基质。结论：小型猪牙周膜干细胞及根尖牙乳头干细胞可被成功的分离培养，在体外表现出良好的生长状态，有望为牙周组织再生和生物牙根再生提供有用的细胞来源。本部分研究内容在Journal of Endodontics发表论文两篇（2008, 34(2): 166-171；2008, 34(6):645-651）。 第二部分 牙周膜干细胞介导修复实验性牙周炎骨缺损的小型猪体内研究 目的：建立稳定可靠的牙周炎模型，探讨利用牙周膜干细胞在小型猪体内修复实验性牙周炎骨缺损的可行性。方法：采用4种骨缺损加结扎丝线的方法建立小型猪实验性牙周炎模型，分别在术后4周、12周和16周进行临床指标（菌斑指数、龈沟出血指数、牙周探诊深度、附着丧失）和影像学观察，确定可靠的建立牙周炎骨缺损模型的方法。用分离培养的第3代牙周膜干细胞与HA/TCP混合后回植于小型猪实验性牙周炎骨缺损部位。用临床指标、影像学及组织病理学结果评价牙周组织修复效果。同时，为了追踪回植牙周膜干细胞在小型猪体内的转归，在体外采用RV-GFP标记牙周膜干细胞，回植于小型猪牙周炎骨缺损处，回植12周后取标本作硬组织切片，荧光显微镜下观察GFP阳性牙周膜干细胞的转归。结果：本研究所采用的骨缺损加结扎丝线的方法可形成稳定的小型猪实验性牙周炎模型。各组在实验前和建模后牙周状况基本相似，基线可比。3.3+0.6mm，HA/TCP 5.3+0.3mm，6.3+0.5mm,单因素方差分析结果表明,附着丧失在三组有显著性差异（P0.0牙周膜干细胞HA/TCP组, 牙周膜干细胞组与对照组，HA/TCP组与对照组间均有显著性差异（均为P=0.000）。CT薄层冠状扫描图显示治疗12，牙周膜干细胞组有明显的新生骨质影像HA/TCP组和对照组的骨再生不明显。, 牙槽嵴顶位于釉牙骨质界下约2 mm，，’s纤维是牙周膜内的典型结构。治疗12周后, 牙周膜干细胞组结合上皮位于釉牙骨质界下0.5～1 mm，，, 牙周膜间隙比正常牙周膜略宽，仍可见Sharpey’s纤维结构。对照组可见结合上皮位于釉牙骨质界下约4 mm，’s纤