表达基因克隆技术与图谱构建策略研究.docVIP

第五章 表达基因克隆技术与图谱构建策略研究 人类基因组计划的主要任务之一就是要从大片段基因组区域或整条染色体DNA 上 鉴定出基因表达序列(gene expressed sequences)或转录单位(transcription units)。在 人 类基因组30亿个碱基对中，发生转录的表达序列(即基因)仅占总序列的3～５％。基因组中 绝大部分是基因间隔序列(intergenic seguences)或 内含子(intron)和各种各样的重复序列。测定基因表达序列可直接鉴别人类目前认定的6～1 0万(或仅3～5万)个基因在染色体上的位置和排列顺序，这就是人类基因组计划所要构建的 第 四张图谱——基因表达图谱，又称基因转录图谱(gene expression maps or gene transcri ption maps)。 基因表达图谱是指细胞内所有染色体上表达基因的排列和分布，即指细胞中所有mRNA。目前 ，人们把很大精力投入到基因表达图谱的研究上，原因是表达基因序列是通过DNA序列的转 录本—mRNA反转录成互补DNA(complementary DNA,cDNA)获得的，即DNA外显子序列转录后形 成RNA，经过剪切形成mRNA之后，再将mRNA连接成模板，合成cDNA。因此，cDNA基因不包含 非转录的内含子序列，这大大减少了测序的工作量，加快了测序进度，并可以有目的的直接 针对某种功能基因尤其是致病基因进行测序、克隆和鉴定。因此，表达基因图谱可作为致病 基因诊断、克隆和基因治疗的工具，帮助科学家鉴定能指导蛋白质合成和引发疾病的DNA片 段，在此基础上，针对疾病基因靶位进行药物设计。可见，表达基因图谱在医学和制药上有 重要的应用价值。 构建表达基因图谱的前提条件是获得大量的基因转录本mRNA序列(cDNA)，该部分序列经转 录、翻译后可直接作为基因表达出来，所以，对cDNA的测序就是寻找基因的表达序列。 在人类基因组测序工作中，“cDNA测序战略”是只测定转录的DNA序列，而不是从“全基因 组 战略”的角度对所有碱基的排序进行测定。具有基因表达功能的cDNA又称表达序列标签(exp ressed sequence tag,EST)，特定的EST序列有时可代表特定的cDNA。实施此战略需从cDNA 文库中获得一些长为300～400个碱基序列的EST，其作用相当于全基因组测序时的序列标定 位点STS。 1990年，人类基因组计划提出了大规模cDNA测序战略，并建立了表达序列标签EST测定技术 。〖HS3〗 第一节 表达基因的克隆策略 80年代，科学家们曾试图通过分析基因产物—RNA或蛋白质获得各种组织尤其是疾 病的 表达基因，从而绕过连锁分析、图谱构建和DNA测序，直接找到表型与基因的相互关系。然 而，事实证明，单纯依靠表型特征无法确定致病基因的具体位置和相关功能，更难以确定 疾病与基因的直接对应关系。随着疾病研究手段的不断发展和人类各种图谱的构建，以标记 位点为基本研究工具的基因克隆使人类研究表型与基因的相互关系成为可能。 基因克隆(gene cloning)是指从基因组或DNA大片段中分离并获得某一特定的基因或DNA序列 ，再通过DNA序列扩增形成由众多拷贝组成的一个DNA片段群体的过程。目前，广泛应用于致 病基因分离与克隆的策略可归纳为位置克隆(positional cloning)、候选位置克隆(candi date positional cloning)、表型克隆(phenotypic cloning)等。 一、定位克隆 定位克隆的总体思路是疾病——染色体定位——基因序列——mRNA／cDNA——蛋 白质 (致病基因产物)。定位克隆是通过分析患病家系的连锁关系确定致病基因的遗传方式，从染 色体畸 变引发的疾病入手，将染色体畸变的位置作为疾病基因克隆的一个位点进行分析的一种克隆 策略，这种策略在基因组内尚无足够多态性位点提供某一疾病的连锁信息时，不失为一种有效的致病基因克隆策略。因此，利用 染色体畸变克隆致病基因是早期研究致病基因的一种重要手段之一。 随着人类基因组遗传图谱和物理图谱的完成，人们可有效地利用图谱标记确定与疾病性状的 连锁关系，并获得这一区域的功能群，进行基因定位克隆。所以，定位主要集中在从重叠的 克隆群中筛选表达序列，从定位的染色体区段内分离所要克隆的基因，经扩增后进一步研究 其功能。 二、定位候选克隆 定位候选克隆是定位克隆的一种改进方法，是目前被认为最有发展前途的基因定位策略。人 类基因组草图问世之后，所有人类致病基因将很快被定位在染色体的某个区域，这样，可从 某局部的序列片段中筛选出致病基因进行结构与功能分析，这就是定位候选克隆。 此法是将图谱的一