10高效液相色谱法(HPLC)HighPerformanceLiquidChromatography.ppt

11 高效液相色谱法 (HPLC) 自学“薄层色谱法”讨论题 HPLC和经典LC比较 高效液相色谱仪方框图 色谱检测器（对流出物进行连续检测） 色谱数据处理 色谱数据处理机和色谱工作站的差别 色谱智能化和专家系统简介 色谱柱（固定相、填料） 色谱柱的结构 柱填料 固定相类型 (Stationary phase) 键合相类型 柱性能测试 : 应指定色谱条件和检测物质 流动相 (Mobile phase) 流动相溶剂的选择 液相色谱中的溶剂强度 洗脱强度与溶剂极性 溶剂强度图 混合溶剂的极性 溶剂选择性分类 流动相的优化 梯度洗脱技术 1．梯度洗脱的特点 2．梯度洗脱的主要条件 3．梯度洗脱的基本原理 何为无死体积柱头连接？ 无限直径效应（无限直径柱）？ 1．填料的特性 1）基质材料 ① 无机基体：硅胶、氧化铝、氧化锆和二氧化钛等 ② 交联聚合物：聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸酯等 ③ 复合材料：无机基体复合一层聚合物 2）形状：球形和不规则 硅胶和硅基仍是目前最广泛应用的液相色谱柱填料。此外还有高分子多孔微球、高疏水表面的多孔碳、无机金属氧化物等。 这类键会固定相具有热稳定好，不易吸水，耐有机溶剂的优点。能在70℃以下，pH2～8范围内正常工作，应用广泛. 硅烷化（≡Si—O－Si－C）键合固定相 制备反应如下： （最常见类型！） 3）粒度及分布范围 4）孔径和耐压性 一般硅胶的孔径在60-125A, 但大孔硅胶的孔径为300-1000A。硅胶填料的产品差异主要取决于： ① 微粒基质的制备过程差异； ② 基质和键合物反应的差异； ③ 柱装填技术专利的差异。 一些键合键新技术： （1）RX技术 (Tx technology) “碱性脱活” （2）SB技术 (Stabilized Bonding) “高覆盖量” （3）封端技术 (End-Capping) 1）为什么要封端？ 2）聚合物柱的特点？ 封端 常规 聚合物 1）按色谱保留原理把填料分为：吸附剂、离子交换剂、涂敷固定液、分级孔径或交联度填料等。 2）按特性分类 ① 硅胶：极性吸附剂 ② 键合固定相 （为什么要键合？） 采用硅胶表面键合技术, 对硅胶微粒表面进行修饰---硅烷化, 使得硅胶表面带有不同的功能团, 以适应不同的分离需要。目前在色谱填料中, 键合相约占78%(其中C18占反相色谱的72%), 硅胶约占10%)。 A.?基质：200-300m2/g的硅胶；聚合物, 如聚苯乙烯和聚乙烯醇胶等。 烷基：C1、C2、C3、C4、C6、C8、C12、C16、C18、C22等反相柱； 苯基：C6H5-, 含有?-?相互作用； 氰基：-(CH2)3-CN, 带有给电子作用、羟基的氢键作用；正相、反相均可。 氨基：-(CH2)3-NH2, 弱阴离子型键合相, 可用于糖分析。 其它极性键合相还有：二醇基Lichrosorb DIOL；硝基Nucleosil-NO2；二甲胺基Nucleosil-NMe2等。 C. 键合层（单层和聚合物） 1．理论塔板高度 2．峰不对称因子：应小于或等于1.2 3．相对保留值和分配比的重现性：精密度应优于5%和10% 4．柱阻力因子：? = 0.1?Pt0dp2÷(109?L2)，多孔填料500-1000 5. 折合塔板高度 流动相（淋洗剂、洗脱剂）是影响液相色谱分离的一个非常重要的实验因素。改变流动相的性质和组成将改变溶质组分的保留值、分离选择性和柱效。 在实际工作中，流动相的可选择范围较大是液相色谱的一个显著特点。 流动相的选择和优化是大多数液相色谱分析的主要研究工作，在合理的时间内, 所用的流动相要能使样品各组分达到足够的分离。 1）什么溶剂适合于液相色谱？ 2）流动相如何影响色谱分离？ 问题： 高效液相色谱流动相溶剂的物化性质（部分） 合适选择性溶剂 液相色谱溶剂选择范围 液相色谱流动相溶剂的选择步骤： ● 选择具有合适物理性质的溶剂，如沸点、粘度、紫外截止波长等 ● 选择合适洗脱强度的溶剂：简单样品，2 ≤ k’≤ 5；复杂样品，0.5 ≤ k’≤ 20 ● 改变溶剂的选择性，使被分离组分具有较高的α值 所有溶剂 合适物理性质溶剂 合适保留值溶剂 考虑溶剂的实用要求：在实际操作中所选用的流动相能保证色谱系统的分离过程可重复进行：溶剂的纯度和化学特性必须满足色谱过程的稳定性和重复性的要求；溶剂应当不干扰检测器的工作；在制备分离中, 溶剂应当易于除去, 不干扰对分离组分的回收。 1．与色谱系统的适应性：溶剂要有一定的化学稳定性, 不与固定相和样品组分起反应。 2．溶剂的纯度（包括毒性和价格） ?? HPLC级：色谱淋洗