酵母葡聚糖硫酸酯化修饰及其对小鼠脾淋巴细胞增殖的促进作用.doc

酵母葡聚糖硫酸酯化修饰及其对小鼠脾淋巴细胞增殖的促进作用 摘 要 目的：研究免疫增强活性较好的酵母葡聚糖硫酸酯(SPS)的修饰条件。 方法：通过 L 9(3)4正交设计对氯磺酸-吡啶法制备 SPS 的工艺进行优化， 并以 MTT 法测定其对小鼠脾淋巴细胞体外增殖的促进作用。结果：最佳修饰条件为氯磺酸∶吡啶=1∶6（V/V），反应温度 70℃，反应时间3h，硫酸基取代度可达 1.092。 在 50～200 μg·mL-1内，最佳工艺所得 SPS 对小鼠脾淋巴细胞生长有显著促进作用，平均增殖率可达 89.85%。 结论：优化方法制备的 SPS 对小鼠脾淋巴细胞生长具有显著的促进作用。 关键词 葡聚糖；酵母；氯磺酸-吡啶法；淋巴细胞 我国的酵母资源十分丰富， 年产啤酒沉淀酵母泥3～5 万吨(干基)，目前该资源仅作为饲料廉价销售或直接作为废物排入下水道， 既造成环境污染又造成资源浪费[1]。酵母细胞壁是生物活性较强的β-1,3 -D-葡聚糖的重要来源之一， 其中碱不溶性 β-1,3-D-葡聚糖占 85%[2]。 由于其分子量大，在水中溶解性差，使其在应用上受到很大限制。 利用现代生物技术对酵母废泥进行充分开发利用，使其中 β-1,3-葡聚糖得以综合利用， 将大力推动医药产业的发展。 多糖硫酸酯化修饰后由于所带硫酸基团的空间位 阻和静电排斥效应改变了原来的空间结构，增加了 糖链的屈伸度，提高了水溶性，从而引起生物活性 的改进与改变 [3] 。 现今多用氯磺酸 -吡啶（Wolfrom）法进行改良， 借以达到不同的修饰目的 [4-6] 。 本研究通过控制酯 化试剂比例、反应时间、反应温度，开展酯化工艺的 研究， 以制备免疫活性较好的酵母葡聚糖硫酸酯 （SPS）。 1 仪器与药材 冷冻干燥机 （ 北京博医康实验仪器有限公司 ）； 二氧化碳培养箱 （Thermo）； 酶标仪 （Bio-Tek）； 倒置 显微镜（Olympus）；透析袋（南京都莱生物技术有限 公司 ）；96 孔培养板 (Costar)。 酵母葡聚糖（纯度 90%，本校微生物学教研室 提供）；无水吡啶、无水二甲基亚砜（DMSO）、刀豆蛋 白（ConA）为 Sigma 产品；RPMI 1640 培养基、新生小 牛血清为 Gibco 产品 ； 四甲基偶氮唑盐 （MTT）为 Amresco 产品；其它试剂均为分析纯。 清洁 II 级雄性 ICR 小鼠，体重(20±2) g；中国药 科大学实验动物中心提供，动物合格证号 SCXK(苏) 2008-0010。 2 方 法 2.1 酵母葡聚糖的硫酸酯化 将吡啶加入附有冷凝管和搅拌装置的三颈瓶 中 ， 置于冰盐浴， 逐滴加入氯磺酸，10 min 滴加完 毕。 再加入酵母葡聚糖 20 mg，立即将其移入预热的 油浴中于 40～100℃恒温反应。 反应完毕后，将反应 液倾入冰水中， 以 10 mol·L -1 NaOH 调至 pH 中性， 以去离子水透析 48 h， 透析液浓缩醇沉、 复溶、冻 干 ，即得 SPS，得率 80.78%。 2.2 SPS 对小鼠淋巴细胞生长的影响 [7] 将小鼠脱颈处死 ， 取脾脏 ， 去外周结缔组织 ， 并用 不含血清的 RPMI 1640 培养液清洗脾脏，以匀浆器研 磨脾脏成单个脾细胞 ，200 目的尼龙筛网滤过 ， 以红细 胞裂解液 1000 r·min -1 离心洗涤细胞两次 ， 以培养基 洗涤一次 ， 最后以含 10%小牛血清的 RPMI 1640 培养 液悬浮细胞 ， 置 37℃恒温、5% CO 2 孵箱中孵育 4～6 h， 除去贴壁的巨噬细胞 ， 悬浮的即为小鼠脾淋巴细胞。 以培养基调整小鼠脾淋巴细胞浓度至 5×10 6 /L，于 96 孔板每孔加 100 μL 细胞悬液， 再加入含 SPS 培养 液（终浓度分别为 50、100、200 μg·mL -1 ），每孔终体积 为 200 μL，同时设定空白对照和阳性对照（ConA，终浓 度 7.5 μg·mL -1 ）。 每浓度设 4 个复孔，置 37℃、5% CO 2 培养 44 h 后，每孔加入 MTT（5mg·mL -1 ）20 μL， 继续培 养 4 h，3000 r·min -1 离心 20 min，弃上清液，每孔加入 DMSO 100 μL，混匀，酶标仪 570 nm 处检测吸光值。 2.3 酵母葡聚糖硫酸酯化条件的优化 [8] 以免疫细胞的增殖率为响应值， 采用 3 因素 3 水 平的正交实验 L 9 (3 4 )对试剂比例、反应温度和反应时间 进行正交试验优化。 正交实验方案及结果列于表 1 中。 2.4 硫酸根含量的测定及取代度的换算 [9] 采用氯化钡 -明胶比浊法测定多糖样品中的硫 酸根含量。分别吸取浓度为 1.0mg·mL -1 的硫酸钾