酶的分离纯化.doc

产磷酸甘油氧化酶菌种的筛选、鉴定及酶的分离纯化与性质研究 酶的分离纯化 第三章 酶的分离纯化 第一节 酶分离纯化工作的基本原则及步骤 第二节 细胞破碎 第三节 酶的抽提 第四节 酶的纯化 第五节 酶的纯度与产量 第六节 酶的剂型与保存 第一节 酶分离纯化工作的基本原则及步骤 1926年Summer制备了第一个结晶酶，自此以后，酶分离纯化工作进展很快，现已有数以百计的酶制成了结晶，相当数量的酶达到了高度纯净，并根据酶的作用特点，理化性质、发展了各种类型的分离纯化方法、试剂和设备。 一、基本原则 二、 酶分离纯化的基本步骤 为了能成功地进行酶的分离纯化，需注意以下两个基本原则： 1. 防止酶变性失效 防止酶变性失效是酶分离纯化工作很重要的问题，这一点在纯化后期尤为突出。一般地，凡是用以预防蛋白质变性的方法与措施，都可考虑用于酶分离纯化工作中。常见的措施有： （1）低温 ：除少数例外，所有操作应在低温下进行， 有有机溶剂存在时，更应注意。 二、酶分离纯化的步骤 酶分离纯化时，一般要经过如下步骤： 1. 细胞破碎： 除在体液中提取酶或胞外酶，一般都要进行细胞破碎，促使胞内酶溶出，以利于抽提。 2. 抽提 3. 纯化 下面分节对这三个基本环节加以介绍 第二节 细胞破碎 细胞破碎的方法很多，有机械破碎法、物理破碎法、化学破碎法和酶学破碎法。 一、机械破碎法 二、物理破碎法 三、化学破碎法 四、酶学破碎法： 通过机械运动所产生的剪切力作用，使细胞破碎的方法，称为机械破碎法，常用的有如下几种。 1. 机械捣碎法： 利用高速组织捣碎机的高速旋转叶片所产生的剪切力，将组织细胞破碎，转速可高达10000r/min。常用于动物内脏、植物叶芽等脆嫩组织细胞破碎，也可用于微生物，尤其是细菌的细胞破碎。此法在实验宝和生产规模均可采用。 通过温度、压力、声波等各种物理因素作用，使组织细胞破碎的方法，该称为物理破碎法。物理破碎法包括如下几种方法； 1. 温度差破碎法： 通过温度的突然变化使细胞破碎。即将冷冻的细胞突然放进较高温度的水中，或将在较高温度中的细胞突然冷冻都可使细胞破坏。 温度差破碎法对那些较脆弱易破的细胞破碎效果较好。 超声波细胞破碎的程度与输出功率和破碎时间有密切关系。同时受细胞浓度、溶液粘度，pH值、温度以及离子强度等因素的影响，必须根据细胞种类以及酶的特性加以选择。 一般操作条件为：音频10kHz或20kHz；功率100、150W；温度0～10℃；pH4~-7；处理时间3 ～ 10min，最好间隔几次操作；细胞浓度和溶液粘度不宜太高，最好采用对数生长期的细胞进行破碎。 超声波破碎在实验室应用具有简便、快捷、效果好等特点，特别适用于微生物细胞的破碎。但要在大规模工业生产中应用，困难很多。 化学破碎法是应用各种化学试剂与细胞膜作用，使细胞膜结构改变而破坏的方法。 化学破碎法中，常用的化学试剂有： 有机溶剂和表面活性剂。 在一定条件下，通过外加的酶或细胞自身存在的酶的作用，使细胞破碎的方法称为酶学破碎法。 第三节 酶的抽提 酶的抽提是指在一定条件下，用适当的溶剂处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂中的过程。 一、酶抽提的主要方法 二、酶提取过程中应注意事项 根据酶提取时，所采用的溶剂或溶液的不同，酶抽提的方法主要有盐溶液提取，酸溶液提取，碱溶液提取，有机溶剂提取等。