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采用微流控芯片技术对人肺三维细胞培养模式的建立和研究杨文清 123513摘要：建立适于进行三维联合细胞培养的微流控芯片平台。设计与制作一个多通道连接的高通量微流控芯片平台．通过向微通道内灌注含有细胞悬液胶质的方法构建三维立体培养体系，并通过注射泵连续供给细胞营养物质以模拟体内细胞生存的微环境，将肺癌细胞与人肺成纤维细胞置于体系中进行近似于人体生理条件下的三维联合细胞培养。简介：细胞培养是肿瘤体外研究中最核心、最基础的技术。目前，对肿瘤细胞的体外培养多采用二维单层细胞培养模式。这种模式下的癌细胞呈均一性。肿瘤与其生长的微环境间的依存作用不强：而体内生长的实体瘤是一个三维的特殊的细胞群体．细胞异质性明显，细胞-细胞、细胞-微环境之间存在着广泛的相互作用和相互影响，与二维单层培养模式存在明显差异。因而，二维单层细胞培养模型不能很好地模拟体内实体瘤的生长特性，其生长速率、形态、胞内代谢活动等都会发生改变。可见，三维细胞培养模式能较好地模拟实体瘤的微环境，也能够较为完整地体现细胞的生物学特征，是模拟肿瘤体内生存状态进行相关研究的理想模式。但目前常规采用的培养瓶、培养皿等平板平台在进行三维细胞培养过程中存在一定的困难，技术上需要进一步改进。微流控芯片又称芯片实验室。指的是把生物和化学等领域所涉及的样品制备、反应、分离检测等基本操作单元集成或基本集成到一块几平方厘米(甚至更小)的芯片上，由微通道形成网络，可控制流体贯穿整个系统，用以取代常规生物或化学实验室，具有高通量、集成化，化学试剂消耗量少等特性。由于微流控芯片通道中液体通过的尺寸与细胞生长所需的空问相匹配，特别合适细胞培养，因此该平台已经成为新一代细胞研究及其重要的技术。方法：2.1微流控芯片的设计与制作：依据体内细胞与细胞、细胞与培养介质间相互作用的特性，流体力学原理以及联合三维细胞培养的需要，设计一个适于进行联合三维细胞培养的多通道连接的高通量微流控芯片。包括：进液池、连接弯曲通道(防止液体逆流)、细胞培养单元、废液池。细胞培养单元包括细胞加样池、两个平行细胞培养池、细胞废液池。每个透道和培养池的大小和直径要一致以保证通道及培养池内的细胞流体力学特性均一。微流控芯片各通道及进样池长宽高及孔径等设计尺寸如图1所示，细胞培养池内三维细胞培养单元如图2所示。细胞培养池中间的浅黄色部分充满含有细胞的胶质，细胞可以在其中联合三维培养；两侧红褐色通道中充满培养基。培养基通过灌胶缓冲区扩散到细胞培养池中达到饱和时细胞进行作用。其中，灌胶缓冲区的作用是防止灌入细胞悬胶时堵塞流体通道。将FreeHand绘制的芯片构道图打印在透明胶片上作为掩模，采用标准光刻工艺制作模具。采用浇筑法．将Sylgard 184硅橡胶弹性体和Sylgard 184固化剂以10：1的比例混合。搅拌均匀，在真空十燥箱巾抽气，倾倒在模具表面，80℃烘烤I h后取出，待冷却后将同化的PDMS剥离；在基片L相应位置钻出进样孔、废液孔、细胞入孔、细胞出孔，然后切割成合适的大小。最后用等离子体活化PDMS基片表面并将之不可逆地键合到载玻片上，制得完整的用于细胞维培养的微流控芯片。2.2 芯片处理：用于胞培养前，芯片首先要经过121℃高压灭菌20 min，紫外线照射30min。2.3微流控芯片平台上的三维动态联合细胞培养当细胞培养瓶中的肺癌细胞SPCA-1与人肺成纤维细胞HFL1处于对数生长期时．分别用0.25%的胰酶消化，充分吹打。以离心半径10cm，1000r/min离心5min。1640培养液配置成2xl05mL的单细胞悬液。将两种细胞悬液按1：I比例混合，再吸取少量混合。细胞悬液与等体积基底膜提取物BME混合，缓慢通过细胞加样孔注入细胞培养池。将细胞装入无菌的装有少许PBS的培养皿中，30min后，待含有细胞的胶质凝固。利用注射泵从进液孔加入新鲜1640培养液，将流量及流速调整为15mm/24h，以进行模拟体内细胞生存的微环境条件下的细胞培养，如图3所示。将其置于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱内进行联合细胞三维培养，分别于24h和72h后观察细胞生长状况。图3微流控芯片连接注射泵模拟体内微环境结果：通过倒置显微镜观察：二维培养模式下人肺腺癌细胞sPCA-l贴壁呈不规则状(图4a)，人肺成纤维细胞HFLI贴壁呈长梭形(图4b)。三维联合细胞培养模式下24 h观察细胞生长状态良好，细胞间连接紧密，人肺腺癌细胞SPCA-I呈球体生长．人肺成纤维细胞HFLI结成网状(图5a)，72 h后观察人肺腺癌细胞SPCA-1围绕在人肺成纤维细胞HFL1周围成串状生长(图5b)。可见三维联合培养模式下细胞形态与二维单层培养模式的伸展状态明显不同。本实验成功完成了在微流控芯片上的人肺腺癌细胞和人肺成纤维细胞的三维立体培养。图4a二维培养人肺癌细胞SP