野外水样的DNA提取方法.doc

野外水样的DNA提取方法 1、用于检测mcyE基因表达的芯片与定量PCR的研究《Development of a Chip Assay and Quantitative PCR for Detecting Microcystin Synthetase E Gene Expression》 MATERIALS AND METHODS： 从无菌的产肝毒素Anabaena sp.90 and Microcystis aeruginosa PCC 7806提取DNA和RNA。藻种在Z8培养基中培养21天，25°C， 5-6μmol m-2s-1不连续光照，采用5μm孔径的聚碳树脂滤器收集细胞。此外，为使qPCR最优化，从15株Microcystis,13株 Anabaena, 2株Planktothrix,2株Nostoc, 及2株 Nodularia提取DNA备用。 2006年6月至9月从Tuusulanja ¨rvi湖采集5个水样。用带槽样板从0-2米深处采集100-250ml复合水样，并用5μm及1μm孔径的聚碳树脂过滤收集。对样品的DNA、RNA及微囊藻毒素进行收集。用于RNA提取的水样在湖滨取样后立即过滤，原位冻存在液氮中。而用于DNA及微囊藻毒素提取的水样运输到实验室后再过滤。在提取前，用于DNA和微囊藻毒素提取的样品冻存在-20°C，用于RNA提取的样品冻存在-70°C。 核酸提取及反转录： 采用bead beating and the cetyltri methylammonium bromide (CTAB) 法提取藻种及野外水样中的DNA（Kolmonen18）。根据Gene Clean Turbo kit指南进行进一步纯化(Q-Biogene)。通过紫外分光光度计(Biophotometer;Eppendorf)测量提取的DNA含量及质量。 RNA提取时，过滤器转换到FastPrep Lysing matrix Etubes (Q-Biogene)，细胞裂解于1 ml PMR1溶液(MO BIO Laboratories Inc.)中，用FastPrep FP120 bead beater(Thermo Electron Corporation)于5m s-1，搅拌40s。随后，用Ultraclean Plant RNA kit Mo Bio Laboratories)分离RNA。对于环境中的RNA样品，将两个过滤器联合使用以增加总的RNA量。提取的RNA用DNase I按说明书（Promega）处理两遍。处理后的RNA用苯酚-氯仿萃取，以使酶失活及去除，乙醇沉淀，用水稀释至终体积为50μl。采用NanoDrop-1000 分光光度计测(Nanodrop Technologies)量RNA的含量及质量。通过mcy E qPCR证实RNA样品中不含DNA。用5 至15μl的RNA作为模版，iScript cDNA synthesis kit (Bio-Rad)为试剂盒将RNA反转录为cDNA。 参考文献：Kolmonen, E., K. Sivonen, J. Rapala, and K. Haukka. 2004. Diversity of cyanobacteria and heterotrophic bacteria in cyanobacterial blooms in Lake Joutikas, Finland. Aquat. Microb. Ecol. 36:201–211. 备注：该文章对水样进行显微镜观察，以便将结果与芯片检测结果作对照 2、《Diversity of cyanobacteria and heterotrophic bacteria in cyanobacterial blooms in LakeJoutikas, Finland. Aquat. Microb》 MATERIALS AND METHODS： 2002年及2004年从几个不同的湖泊采集水样。采用铺平板法分离单细胞蓝藻，重复该步骤3次或3次以上。（Shirai，1989） 采用两步分离法（Shirai,1991）分离无菌藻种。简要地说，就是通过将含藻细胞的液体以1：100稀释后，用漩涡混合器摇动生长中期的培养基，使群落分散开，用1.5ml的离心管取1ml该培养液于400×g，20℃离心20min。接着，8，000×g离心10min，用微量吸液管将处于表层的悬浮细胞（1μl）吸取后平铺到CB琼脂培养基中（0.4%的琼脂糖LO3，Takara Bio,Otsu,Japan）.M.aeruginosa K-139,其mcy基因结构已经鉴定，被用作mcy阳性克隆。藻类培养条件：30℃，35μmol m-2s-1白炽灯连续光照。