野生干蕨菜对亚硝酸盐清除作用研究实验方案.doc

野生干蕨菜对亚硝酸盐清除作用研究实验方案 2.实验方案 2.1.仪器 分光光度计、电子天平、粉碎机、比色皿、移液管、烧杯、棕色容量瓶、三角瓶、恒温水浴锅、精密pH值试纸 2.2．试剂 对氨基苯磺酸、盐酸萘乙二胺、亚硝酸钠、柠檬酸、柠檬酸钠、盐酸、氨水均为分析纯，蒸馏水。 对氨基苯磺酸溶液（0.4 %）称取0.4g对氨基苯磺酸，溶于100mL20%盐酸中，置棕色瓶中混匀，避光保存； 盐酸萘乙二胺溶液（0.2 %）：称取0.2g盐酸萘乙二胺，溶解于100mL水中，混匀后，置棕色瓶中，避光保存； 亚硝酸钠标准溶液：准确称取0.1000g于硅胶干燥器中干燥24h的亚硝酸钠，加水溶解移入500 mL容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀。此溶液每毫升相当于200μg的亚硝酸钠； 亚硝酸钠标准使用液：临用前，吸取亚硝酸钠标准溶液5.00，置于200容量瓶中，加水稀释至刻度，此溶液每毫升相当于5μg亚硝酸钠 O.5mol/L柠檬酸—柠檬酸钠缓冲溶液（pH=3.0）：取0.1mol/L柠檬酸18.6ml（21.01gm/l），0.1mol/L柠檬酸钠1.4ml（29.41g/ml）加蒸馏水定容至100ml。 盐酸（0.1mol/l）：量取5ml盐酸（35%-37%），用水稀释至600ml。 25%氨水； 2.3.原料 野生干蕨菜。 2.4．实验方法 2.4．1. 样品的制备 将干蕨菜粉碎，称取7份5g蕨菜粉，分别加入7个三角瓶中，各加入30ml蒸馏水，在不同条件（温度、时间、配比，pH值）下提取，然后用4000 r/min转速离心10 min，取上清液备用。 2.4．2. 最大吸收波长的确定 准确吸取5μg/ml硝酸钠标准液7ml置于25ml容量瓶中，加入0.4 %对氨基苯磺酸1.0mL，摇匀，静置4min，加入0.5mL0.2 %盐酸萘乙二胺，加水定容至刻度,摇匀，静置15min。另以蒸馏水代替亚硝酸钠，用同样配制方法的溶液作为空白（即参比溶液），做光谱扫描, 测定最大吸收波长。 2.4．3. 标准曲线的绘制 分别吸取0.00、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00、7.00mL亚硝酸钠标准使用液分别置于25ml容量瓶中，加入0.4 %对氨基苯磺酸1.0mL，摇匀,静置4min，加入0.5mL0.2 %盐酸萘乙二胺，加蒸馏水定容至刻度,摇匀，静置15min于最大波长处测定吸光度。以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线，另以蒸馏水代替亚硝酸钠，用同样配制方法的溶液作为空白（即参比溶液）。（R=0.999） 2.4．4 .样品提取液对亚硝酸盐的清除能力的测定 准确吸取5μg/mL NaNO27mL，置于25mL容量瓶中，加入5mL蕨菜提取液，反应10min，然后加入0.4%对氨基苯磺酸1mL，摇匀，静置4min,再加入0.2%盐酸萘乙二胺0.5mL，摇匀加水定容至25mL，静置15min，用2cm 比色皿于最大吸收波长处测定吸光度A1；以蒸馏水代替提取液做空白，测得吸光度A2。按下式计算蕨菜提取液对亚硝酸盐的清除率。 清除率（%）=（A2-A1）/A2×100% A1—加蕨菜汁提取液测得值； A2—未加蕨菜汁提取液测得值。 2.4．5. 浸提温度对清除亚硝酸盐的影响试验 取在不同温度（20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃）水浴下提取液7份5mL于7个25mL容量瓶中，均加入5μg/mlNaNO27ml，在室温下反应10min，均加入对氨基苯磺酸，盐酸萘乙二胺定容、显色，测得在最大吸收波长处的吸光值，试验重复三次，计算清除率。 表1不同提取温度对亚硝酸盐的清除率 温度（℃） A1(n=3) A2(n=3) 清除率（%） 20（室温） 30 40 50 60 70 80 2.4．6 .蕨菜汁提取液与亚硝酸盐提取时间试验 取在不同提取时间（0min、30min、60min、90min、120min、150min、180min）下提取液7份5mL于7个25mL容量瓶中，均加入5μg/mlNaNO27ml，在室温下反应10min，均加入对氨基苯磺酸，盐酸萘乙二胺定容、显色，测得在最大吸收波长处的吸光值，试验重复三次，计算清除率。 表2不同提取时间对亚硝酸盐的清除率 时间（min） A1(n=3) A2(n=3) 清除率（%） 0 30 60 90 120 150 180 2.4．7. 蕨菜汁用量对亚硝酸盐清除率的影响试验 取在不同提取配比下的提取液（0ml、1ml、2ml、3ml、4ml、5ml、6ml）7份5mL于7个25mL容量瓶中，均加入5μg/mlNaNO27ml，在室温下反应10min，均加入对氨基苯磺酸，盐酸萘乙二胺定容、显色