银染聚丙烯酰胺检测牙鲆微卫星DNA实验方法的分析探讨.doc

银染聚丙烯酰胺检测牙鲆微卫星DNA实验方法的分析探讨 杜爽 杨磊 仇雪梅 摘要：为了筛选和检测牙鲆种群中具有较好表现的微卫星多态性,对聚丙烯酰胺凝胶及银染方法进行了选择。经过反复的实验，总结出了一套适用于牙鲆微卫星检测的方法。该方法具有灵敏度高、背景浅、污染小、条带清晰等突出特点,能有效地控制染色背景,显著提高检测分辨率,整个染色过程所需时间短,具有广泛的推广价值。 关键词:银染;微卫星;聚丙烯酰胺凝胶 　微卫星DNA(microsatellite ) 又称简单序列重复(Sample Sequence Repeats ,SSR) ，一般以1～6 个碱基为核心序列，经过多次的串联重复组成的长达几十个核苷酸的序列[1]。 与其它分子标记相比，微卫星标记具有的优点:微卫星标记具有座位数目巨大并随机分布于基因组中(内含子、外显子、基因间序列)、多态性丰富、共显性遗传方式、分析方法简单、重复性好和近缘种中引物通用性高等优点,在动物的群体遗传分析、亲子鉴定、基因 组作图和遗传育种中得到了广泛的应用[2] [3]。 微卫星PCR 产物的检测方法主要有荧光标记引物的测序法,同位素标记引物的聚丙烯酰胺电泳法,以及银染变性或非变性聚丙烯酰胺凝胶方法。目前很多国内外的实验室都是通过银染的方法来鉴定微卫星产物。在鱼类微卫星PCR产物的鉴定中，变性或非变性聚丙烯酰胺凝胶方法都有所报道[4] [5]。 本次实验，我们在应用微卫星标记对牙鲆群体的检测工作中,对银染聚丙烯胺凝胶电泳技术的最适条件进行了探索,经过多次实验,最终研究找到了其最适条件，可以对牙鲆微卫星DNA扩增产物进行更为准确、可靠的鉴定分析。 材料和方法 材料 1.1.1 样本 大连海域牙鲆群体30尾,取其肌肉加入70%乙醇后放入-20℃保存备用。 1.1.2 微卫星引物 从NCBI上下载牙鲆微卫星序列，经过Primer 5设计引物，由上海生物工程技术服务公司合成引物，并按照说明溶解引物。 方法 基因组DNA的提取 采用文献[6] 的酚、氯仿法抽提牙鲆的基因组DNA ,得到的DNA加TE溶解后置-20 ℃冰箱中备用。 1.2.2 PCR反应 PCR反应总体积为25ul，内含100ng的模板DNA，0.4umol/L的dNTPs，1.5mmol/L的Mg2+， 1×PCR反应缓冲液，0.25ulTapDNA聚合酶（Promega）。反应在Eppendorf Mastercycler PCR扩增仪上进行。PCR反应为30个循环，每个循环包括94℃变性35s，退火30s，72℃延伸40s；首次循环前预变性5min，最后一次循环结束后72℃再延伸5min。 聚丙烯酰胺凝胶的配制 变性聚丙烯酰胺凝胶的配制 表一 不同浓度变性聚丙烯酰胺凝胶的配方 药品与试剂 浓度 6% 浓度 4% 尿素 12.6 (g) 12.6 (g) 双蒸水 14.5 ml 16 ml 10×TBE 1.5ml 1.5 ml 40%丙烯酰胺溶液(38:2) 4.5ml 3ml 10%过硫酸胺溶液 200μl 200μl TEMED 15μl 15μl 总体积 30ml 30 ml 非变性聚丙烯酰胺凝胶的配制 表二 不同浓度非变性聚丙烯酰胺凝胶的配方 药品与试剂 浓度 8% 浓度 10% 浓度12% 30%丙烯酰胺溶液(29:1) 8ml 10ml 12 ml 5×TBE 6ml 6 ml 6ml 双蒸水 16ml 14ml 12 ml 10%过硫酸胺溶液 200μl 200μl 200μl TEMED 15μl 15μl 15μl 总体积 30ml