镜像选择(MOS)消除抑制性消减杂交文库中假阳性克隆的方法1.doc

镜像选择（MOS）：消除抑制性消减杂交文库中假阳性克隆的方法 摘要： 抑制性消减杂交（SSH）是分离差异表达转录本最有力，最普遍的方法之一。然而，SSH方法构建的文库经常含有一些代表非差异表达转录本的背景克隆。为克服这一困难，我们研究了一个简单步骤，能充分降低背景克隆的数目。这一方法的是以存在于目标与背景cDNA间的以下差异为基础的：各种背景克隆分子只单向对应于SSH中两种不同侧翼接头序列中的一种，而真正差异表达的cDNA片断同时具有两种侧翼接头序列。本文描述的方法能够筛选因这类镜像分子杂交而数目增多的分子。 引言： 研究许多生物学过程遗传特性最有力的方法是鉴定在这些过程中表达水平有所变化的基因。抑制性消减杂交（SSH）（1，2）是差异表达基因鉴定中应用广泛，效率较高的一种基于PCR的方法（3－5）。它的一个关键特征是在消减的同时标准化，后者可使消减群体中目标cDNA的丰度均等。由此，能富集稀有的差异表达转录本达1000倍。但SSH实验的成功应用受限于包括cDNA样本高度复杂和cDNA样本间差异（目标）基因数目少等因素。 SSH主要的缺点是在消减文库中存在一些代表非差异表达（冗余）cDNA的背景克隆。某些较难的例子（如脊椎动物大脑样本）中，消减文库中背景克隆的数目可能超过目标克隆的数目。尤其富有挑战性的问题是初步筛选过程中出现包括所谓的“假阳性” 克隆在内的差异信号，但无法通过进一步仔细分析来确定。为克服这一问题，我们研发了一个简单步骤，能充分降低SSH方法构建文库中背景克隆的数目。 材料与方法 手术摘取E15.5和E13.5小鼠胚胎的端脑。去除脑脊膜后，从剩余的脑组织（基本神经中枢、海马和嗅核）中分离皮质。按文献（6）方法纯化总皮质RNA。人骨胳肌polyA+RNA购自Clontech(CA),φХ174 DNA购自Promega(WI)。用模板转换技术（SmartTM PCR cDNA Synthesis Kit;Clontech）合成双链cDNA。 然后用PCR-SlecteTM cDNA Subtraction Kit（Clontech；详细方案见7，8）消减PCR扩增的cDNA。我们在SSH方案中引进了若干能提高这一方法效率的修改。一般要想得到成功的SSH结果,初步PCR不能多于27个循环。这与有约1000或更多的cDNA分子被扩增相应（9，10）。对于我们的大脑cDNA消减，为了扩增消减样本到10－20ng/μl的浓度，初步PCR需要30个循环。为克隆这一问题，我们进行了10管独立的初步PCR，合并样本并稀释1000倍。而后用与初步PCR同样的引物和条件进行10－12个循环的PCR再次扩增到样本浓度达10－20ng/μl。这一额外的PCR步骤大降低了那些可能在第二步PCR中（或后）被扩增的背景分子的比例。这类背景cDNA来自于检测子与检测子的同源杂交，其末端和起始端只与两个巢式PCR引物中的一个相连接（NP1或NP2，见下文）。这类两侧端对称的分子的扩增，因抑制性PCR效应，在初步PCR中被抑制，但能在第二步PCR中扩增。这一类型的背景对于镜像选（MOS）是相当危险的，因MOS过程是基于对两侧对称连接NP2R引物的cDNA分子的选择。第二步（巢式）PCR用以下引物进行：NP1，5ˊ-TCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT(划线处为XmaI限制性内切位点)；NP2R，5ˊ-AGCGTGGTCGCGGCCGAGGT。PCR产物酚／氯仿抽提，乙醇沉淀。沉淀用适量NTE缓冲液（10mM NaCl, 10mM Tris-HCl,0.1mM EDTA）溶解，要求cDNA浓度为20－30ng/μl。5μl cDNA样本与2μl 10×XmaI 内切酶缓冲液，12μl水和1μl XmaI（10U/μl）混合，37℃反应1小时，以去除NP1接头。然后，加2μl 200mM EDTA，70℃加热10分钟，灭活酶。1微升XmaI消化cDNA（5－7ng）与1μl 4×杂交缓冲液（2 M NaCl,200mM HEPES pH 8.3,0.8 mM EDTA），2μl 水［在某些模式实验中或是加2μl驱赶子人骨胳肌cDNA (300 ng/μl)］在热循环仪中98℃加热1.5分钟，然后68℃加热3－12小时。须注意，在理论上杂交持续时间对MOS的结果有很大的影响。杂交时间太短会导致高丰度cDNA富集较多，而稀有cDNA 因重退火的二级动力学而丢失。典型SSH样本，其复杂程度应不超过103种独立的cDNA。这类低复杂度的样本在相对较短的时间内就能几乎完全重退火。我们的实践表明3小时的杂交时间是足够的,继续延长杂交对MOS的效率几乎没有什么影响。杂交后，样本与200μl的稀释缓冲液（50 mM NaCl,20 mM HEPES pH