2013淋球菌菌株分离与牛奶管制作SOP.docVIP

淋球菌临床菌株的收集流程图 淋球菌临床菌株的收集SOP 1、标本的采集、接收与处理 1.1标本采集的基本要求 1.1.1应使用正规的检查方法和试剂，取材方法要简便，不需要使用特殊的仪器。 1.1.2取标本以不损伤病人为好，尽量使用非侵入性采集方法。 1.1.3所用的器材对病原体的活力无影响或影响很小。 1.1.4操作应规范化。如取材后需要做细菌培养，应尽快接种。 1.1.5应由医务人员亲自采集标本，一般不应由病人自取。 1.1.6所有标本都应当被视为具有传染性，医务人员应戴手套谨慎操作。 1.2淋球菌培养的标本取材 1.2.1男性患者：将男性采样拭子深入到尿道内2—4cm处，轻轻转动并停留10—15秒钟后取出，取出的分泌物带有黏膜细胞。 1.2.2女性患者：从女性患者的宫颈取材时，应先用温水湿润扩阴器（不可用液体石蜡等润滑油），然后将女性采样拭子插入宫颈管1-1.5cm处，轻轻转动并停留20—30秒取出。为了提高阳性率，可同时取两份标本进行培养。 1.3标本接收的标准 1.3.1标本登记：登记内容详见淋球菌菌株来源登记表。 1.3.2 对不合要求的标本，可以拒绝接收。 2、淋球菌的实验室检测 2.1分泌物涂片显微镜检查 2.1.1原理 淋病感染者的泌尿生殖道常见有黄色脓性分泌物，取分泌物作涂片，经过革兰染色后，在显微镜下可见在多形核白细胞内或周围紧相连处有红色的呈双肾形排列的双球菌。 2.1.2方法 涂片：将拭子在载玻片上轻轻滚动涂片。 固定：待涂片在室温中自然干燥，涂片经火焰固定。 革兰染色：（BASO珠海贝索快速革兰氏染色液） ①第一液（龙胆紫液）：染10秒，水洗甩干。 ②第二液（碘溶液）：染10秒，水洗甩干。 ③第三液（脱色液）：脱色10-20秒，水洗甩干。 ④第四液（沙黄溶液）：复染10秒，水洗甩干。 镜检：晾干后的载玻片滴加香柏油，先在低倍镜下找到视野后转换到油镜观察结果。 2.1.3结果 2.3.1.1结果判读： 淋球菌为革兰氏阴性菌，经革兰染色后呈红色，肾形，常呈双排列，两菌接触面扁平或稍凹。菌体长约0.7um,宽约0.5um。 2.3.1.2结果报告： 根据镜检的“多形核白细胞内找到革兰阴性双球菌”、 “多形核白细胞外找到革兰阴性双球菌”和 “未找到革兰阴性双球菌”三种结果做出相应的报告。 2.1.4临床意义 取自男性急性淋球菌性尿道炎患者的标本，检测敏感性及特异性高达95%，作为临床诊断的依据。 不推荐用涂片法对女性感染者，亚临床感染和疗效检测者以及取自直肠和咽喉等其他部位的标本进行判断。 如果在多形核细胞外见到形态典型的革兰阴性双球菌，需做培养进行确证。 从患者采集的标本，涂片革兰染色结果阳性，不可直接报告“找到淋球菌” 2.1.5注意事项 应根据感染者的性行为方式、病史、临床表现和检测目的，合理的选择采集标本部位。 涂片时不要用力涂擦，而应将棉拭子在玻片上轻轻滚动。涂擦过度或来回涂擦，会使细胞膜破裂或变形，淋球菌从胞内溢出来。 涂片厚薄要适宜，脱色时间要根据涂片厚薄做适当调整。 革兰染色试剂：BASO珠海贝索快速革兰氏染色液，试剂要做定期的质量检查。 找到“革兰阴性双球菌”后按照检测操作规程，根据需要作分离培养及生化鉴定。 单纯在细胞外查到革兰阴性双球菌不能定为淋球菌，应作培养鉴定。诊断淋病一定要遵守细胞内查到革兰阴性双球菌的原则。 2.2淋球菌的分离培养 2.2.1原理 淋球菌可以在营养丰富的培养基上及合适的环境下培养，并且生长成有一定特征的菌落。淋球菌培养法是诊断淋病的主要依据，分离的单个菌落经纯培养后，可以进一步进行鉴定。 2.2.2方法 2.2.2.1 培养（也可购买成品淋病奈瑟氏菌培养基） 2.2.2.1.1T-M培养基的配制 (1)准备： 成分： GC基础粉：36g/L 血红蛋白粉：20g/L VCN抑菌剂：每L添加2瓶 VITOX添加剂; 每L添加2瓶 器皿： 三角烧瓶（1L、500ml各一个）：清洗并晾干 水浴箱：调至50℃备用 分析天平:开机预热30分钟 生物安全柜：紫外线消毒30分钟 加热磁珠搅拌器 无菌平皿 (2)配制： 制备双倍浓度的基础培养基：将GC基础粉36g溶于488ml蒸馏水中（用1L烧瓶），充分混匀，边加热，边搅动，直至煮沸1分钟，使其完全溶解。 将20 g血红蛋白粉加到100ml蒸馏水中研成糊状，再逐步加入蒸馏水至488ml制成溶液。 将上述二液分别121℃高压灭菌15分钟，冷却到50℃左右备用。 配制VCN抑菌剂：每安瓿抑菌液以无菌手续加入蒸馏水2ml，摇动，使充分溶解。 配制VITOX增菌剂：每安瓿增菌剂以无菌手续加入所附的稀释液10ml，摇动，使充分溶解。 以无菌手续将GC培养基488ml、血红蛋白溶液488ml、增菌剂20ml和抑菌剂4ml混合倾注平皿至4