06常用分子生物学技术.pptx

第六章 常用分子生物学技术Common Molecular Biology Technique陈耕夫生物化学与分子生物学系基础学院 广东药学院主要内容一、分子杂交技术二、目的基因制备技术三、遗传修饰动物模型的建立四、RNA干扰技术五、蛋白组学研究常用技术一、分子杂交技术（一）什么是核酸杂交？（二）核酸探针（三）DNA杂交技术（四）其他杂交技术（五）生物芯片（六）核酸杂交技术的应用（一）什么是核酸杂交？ 核酸杂交（nucleic acid hybridization）是指碱基序列互补但来源不同的单链DNA和DNA、DNA和RNA、RNA和RNA，根据碱基配对原则，借助氢键相连而形成的双链杂交分子的过程。核酸的变性与复性核酸杂交（二）核酸探针1. 什么是核酸探针？ 核酸探针（probe）是指为了检测核酸样品中是否存在某段核酸特征序列而人工设计的、能够与靶分子核酸按碱基互补原则特异性相互作用的一段已知序列的寡核苷酸或核酸。（二）核酸探针2. 核酸探针的标记 核酸探针的标记是指探针以共价键形式结合能够产生强烈信号的基团、原子或能够与一些产生强烈信号分子特异性结合的配体。核酸探针标记的目的 利用探针的标记物特定性质来跟踪检查探针，从而确定是否存在核酸靶序列或者确定核酸靶分子所在位置。非同位素标记核酸探针检测原理（二）核酸探针3. 核酸探针标记的常用方法放射性同位素标记法 如3H、32P、35S、125I等非放射性标记法半抗原：生物素、地高辛荧光素：异硫氰酸荧光素和罗丹明配体：生物素光密度或电子密度标记物： 金、银待检测核酸样品的制备标记探针的制备检测样品中是否存在目标序列（三）DNA杂交技术 DNA杂交技术是一种以DNA的特异序列（探针）检测目标DNA样品中是否存在能与探针碱基配对的核酸杂交技术。 该方法在1975年由Southern首先创建，故该方法又称为Southern印迹（Southern blot）。（三）DNA杂交技术1. 样品的制备 ① 核酸样品的提取分离 ② 酶切、电泳分离、核酸变性等 ③ 样品核酸转移到硝酸纤维膜或尼龙膜 ④ 预杂交：封闭硝酸纤维膜或尼龙膜上核酸结合位点，防止探针直接与膜结合2. 探针的制备3. 待测样品核酸序列的检测 ① 杂交——待测样品与探针的复性 ② 洗膜——除去多余未杂交探针 ③ 检测——依据探针特点检测探针信号含已知的重组质粒菌落杂交样品的制备标记探针的制备组织或细胞基因组DNA提取质粒DNA限制性内切酶降解及电泳分离、变性限制性内切酶降解及电泳分离转移到硝酸纤维膜或尼龙膜回收含已知基因的DNA片段，并标记预杂交基因探针检测样品核酸序列检测杂 交 (待测样品与探针的复性)洗 膜( 除去多余未杂交探针 )放射自显影核酸杂交技术的基本过程分离转膜杂交自显影（四）其他杂交技术1. Northern印迹（northern blot） 应用DNA探针检测特异mRNA的一种杂交技术。（四）其他杂交技术2. Western印迹（Western blot） 又称蛋白质印迹，是用于目的蛋白质定位检测的实验方法。 其过程与Southern印迹相似： 将电泳分离的蛋白质转移至硝酸纤维素膜或尼龙膜上，再以免疫反应或亲和反应检测经电泳分离的样品中能与免疫反应或亲和反应的标记配体特异性结合的蛋白质区带。Western Blot（四）其他杂交技术3. 原位杂交（in-situ hybridization） 在组织或细胞水平，使用标记探针与细胞内DNA或RNA杂交的方法。原位杂交人类端粒DNA荧光原位杂交相片（五）生物芯片 生物芯片（biochip）是将核酸、多肽、蛋白质分子、组织切片和细胞等制成探针，以预先设计的方式有序地、高密度地排列在玻片或硅片等载体上，构成二维分子阵列，然后与待测生物样品靶分子杂交，通过检测杂交信号实现快速、高效、高通量样品检测。 依据待检测样品的性质，生物芯片又分为基因芯片（DNA芯片）、蛋白质芯片、细胞芯片、组织芯片等。基因芯片 又称为DNA芯片，是将DNA以大规模阵列的形式排列，形成了可与目的分子相互作用的固相表面。基因芯片与目的分子作用后激发出不同波长荧光，通过计算机分析结果。基因芯片检测原理蛋白质芯片及其应用From the following article:/nature/journal/v422/n6928/full/nature01512.htmlProtein analysis on a proteomic scale, Eric Phizicky, et al.,Nature 422, 208-215(13 March 2003)（六）核酸杂交技术的应用1. 在个体识别中的应用S 嫌疑人DNAE 现场DNA证据V 受害人DNA（V右侧是另一嫌疑人）（六）核酸杂交技术的应