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RNA抽提指南(TRIZOL)
注意事项:
* 全程佩戴一次性手套。皮肤经常带有细菌和霉菌,可能污染RNA的抽提
并成为RNA酶的来源。培养良好的微生物实验操作习惯预防微生物污染。
* 使用灭菌的,一次性的塑料器皿和自动吸管抽提RNA,避免使用公共仪
器所导致的RNA酶交叉污染。例如,使用RNA探针的实验室可能用RNA酶
A 或T1来降低滤纸上的背景,因而某些非一次性的物品(如自动吸管)可
能富含RNA酶。
* 在TRIZOL 中,RNA 是隔离在RNA 酶污染之外的。而对样品的后续操
作会要求用无RNA 酶的非一次性的玻璃器皿或塑料器皿。玻璃器皿可以在
150°C 的烘箱中烘烤4 小时。塑料器皿可以在0.5 M NaOH 中浸泡10 分钟,
用水彻底漂洗干净后高压灭菌备用。
抽提步骤:
1.匀浆化作用
通过离心来沉淀细胞后,弃上清,用移液管加TRIZOL试剂反复吹打来裂解细胞至均一通亮的液态后,将匀浆样品在15—30°C 条件下孵育5 分钟以使核蛋白体完全分解。
(每5—10×106的动物细胞,植物或酵母菌细胞或每1×107 细菌加1ml的TRIZOL。在加入TRIZOL前应避免洗涤细胞因为那样会增加mRNA降解的可能性。)
2.分离阶段
每1 mlTRIZOL 加0.2 ml 氯仿。盖紧样品管盖,用手用力摇晃试管15 秒并将其在30°C 下孵育2—3 分钟。在2—8°C 下以不超过12,000×g 的离心力高速冷冻离心15 分钟。离心后混合物分成三层:下层红色的苯酚-氯仿层,中间层,上层无色的水样层。RNA 无一例外地存在于水样层当中。水样层的容量大约为所加TRIZOL 容量的60%
3.RNA的沉淀
将水样层转移到一干净的试管中,通过将水样层和异丙醇混合来沉淀RNA。最初均化时的每1 mlTRIZOL 对应0.5 ml 异丙醇。将混合的样品在15—30°C 条件下孵育10 分钟并在2—8°C 下以不超过12,000×g 的离心力高速冷冻离心10 分钟。RNA沉淀在离心前通常不可见,形成一胶状片状沉淀附着于试管壁和管底。
(如果希望分离DNA 和蛋白,有机层同样要予以保留。在除去水样层后,样品中的DNA 和蛋白也能相继以沉淀的方式还原。乙醇沉淀能析出中间层的DNA,在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白。共纯化DNA 对于样品间标准化RNA 的产量十分有用。)
4.RNA的洗脱
移去上层悬液。用75%的乙醇洗涤RNA 沉淀一次,每1 ml 的TRIZOL 至
少加1 ml 的75%乙醇。旋涡振荡混合样品并在2—8°C 下以不超过7,500×g
的离心力高速冷冻离心5 分钟。
5.RNA的再溶解
在操作的最后,简单干燥RNA沉淀。尤为重要的是,不能让RNA沉淀完全干燥那
样会极大地降低它的可溶性。部分溶解的RNA样品其A260/280 比值 1.6。用移液管尖分几次移取无RNA酶的水或0.5% SDS溶液来溶解RNA,并在55—60°C下孵育10 分钟。
TRIzol法抽提总RNA
组织100mg
↓
加1mlTRIzol
↓
匀浆(要彻底,后转至EP管)
(组织匀浆量100mg时分装1ml/每EP管)
↓
颠倒混匀10下,室温5分钟(30°C孵育)
↓
加氯仿1/5体积(0.2ml)(必须按总体积的1/5)
↓
颠倒混匀15S,室温2-5分钟(30°C孵育)
↓
4℃,离心12000g,l)于另一1.5mlEP管中
↓
加等体积异丙醇(约400 -500μl),混匀室温10分钟
↓
4℃,离心12000g,1030°C孵育)
↓
弃上清
↓
加冰预冷的75%乙醇(用DEPC水配)1ml
↓
4℃离心7500g,5l(10μl-20μl)
(可在55-60℃水中,10分钟助溶)
RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit
冰上操作:在100μl EP管(经DEPC 水处理过并消毒备用的)中加入
RNA ( ? ) 0.1-5μg
Oligo(dT) primer (0.5μg/μl) 1 μl
OR randon hexamer primer (0.2μg/μl) 1 μl
Deionized water TO 12 μl
离心混匀
2.孵育: 70℃ 5min
0℃ 冰水浴立刻终止 离心
3.加冰上操作 5×reaction buffer
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