免疫印迹201300111.ppt

免 疫 印 迹(Immunoblot / Western blot) 吴　砂 副教授 smu_imm@ 基础医学院免疫学教研室 2012.12 免 疫 印 迹(immunoblot/westernblot) 又称蛋白质印迹 凝胶电泳和固相免疫测定技术结合起来的一种免疫生化技术。 借助特异性抗体鉴定抗原 基本原理 在电场作用下将电泳分离的蛋白由凝胶转移至固相载体，用识别此多肽的抗体进行检测 ★WB的灵敏度可达到标准的固相放射免疫分析的水平而又无需对靶蛋白进行放射性标记。 ★此方法可检测出1-5ng中等大小的待检蛋白。 基本步骤 1.检测样品中的蛋白。基于：被测蛋白与抗体的特异性结合以及蛋白质的相对分子量 2.未知抗原与已知蛋白的关系 3.评价新抗体的特性 4.蛋白质酪氨酸残基是否发生磷酸化 5.不能用于检测蛋白质的生化特性、化学修饰或半寿期 基本流程 1.将蛋白质经凝胶电泳按分子量大小不同依次分离 SDS.将分离的组分转印到印迹膜 转印 3.对转印到印迹膜的蛋白成分进行免疫学检测 杂交显色  第一部分：SDS将玻璃板洗净擦干(水幕流下) 2) 按下表配制10％的分离胶，充分混匀后沿两板夹层滑动均匀倒入，距短板上沿2.5 cm左右时停止，滑动加入少许去离子水覆盖胶面，室温聚合30～60min。 分离胶(8 ml) 积层胶 3) 倒去顶层水，用滤纸吸去表面水分。 4) 按下表配制积层胶，混匀后用1ml移液器加入， ，插入梳子,室温聚合30min左右。 SDS作用 SDS 是一种离子性的界面活性剂,它有强离子性的硫酸根离子也带有疏水性的长碳链. 当 SDS 与蛋白质混合时,它会以其碳链与蛋白质之疏水性胺基酸结合将蛋白质包起来,而以硫酸根离子外露与水分子作用. 大多数蛋白质和 SDS 的平均结合量是 1:1.4 (以重量为单位), SDS 带强负价,使蛋白质原先的带电价微不足道,变性的多肽与SDS结合并因此而带负电荷 因此SDS多肽复合物在聚丙烯酰凝胶电泳中的迁移只与多肽的大小相关。 水的作用 压平 隔氧:大气氧能淬灭自由基，阻止多聚体链长的增加。 常见问题 两块玻璃板之间灌胶,胶为什么总是不平? 1) 玻璃没有洗干净，应该要洗得非常干净！ 2) 过硫酸铵和TEMED的加量不合适，加量相对较多，凝胶凝固过快也会胶不平，最多按照分子克隆加倍。 3) 加完试剂以后没有很好的摇匀，导致有些部位的聚合剂浓度过高，聚合相对较快造成胶不平。 4) 稍微注意手法，均匀加入。 5) 灌胶后应该用水或者正丁醇压胶面 胶为什么总是漏？ 1） 每次电泳完后，洗净玻璃、胶条和其它附件。 2） 避免玻璃边缘（与胶条接触处）破损，尤其和胶条接触的地方。 3） 关键是找一块很平的桌面，使两块玻璃底面非常齐就行了。 4） 胶条一定要干，跑完电泳后，胶条就放在实验台上晾着。 5） 下面的胶条注意不要老化 胶不凝 　1）试剂过期：重新配制 　2）APS,TEMED过少：加倍 (胶脆，后期操作易碎) 　3）配液PH值不对：重新加 4) 环境温度过低：25度左右较好。 　 具体步骤 样本: 经过还原剂处理的小鼠血清(还) 未经过原剂处理的小鼠血清(非) 用1×SDS电泳缓冲液加满电泳槽的上下槽，小心拔出梳子，用移液器样品液加入到孔中，15ul/孔。 蛋白质样品的制备 快 冷 蛋白酶抑制剂 组织样本处理方法 ★在加热组织裂解液时，肝脏和肾脏组织要特别注意其本身浓度，最好是在制作裂解液时就适当稀释，否则加热后会凝结成固态。 有些组织处理后很粘稠，有带丝状物，这是未裂解的核酸，可以适当离心后再用。 样品可能出现的问题: 电泳具体步骤： 积层胶： 100V 分离胶： 140V接通电源 ■溴酚蓝达到胶的底部时，关掉电源，停止电泳。 不应让溴酚蓝泳出底部 ■考马氏亮兰染色，脱色(选做) 凝胶电泳—SDS胶厚度的使用低限为0.4mm.较厚的凝胶上加入较多的样品可提高灵敏度,但厚度必须2mm.最大灵敏度获得:胶厚达1.5mm,加大蛋白的上样量. 长胶可提高蛋白质的分辨率.必要时可让某些标志物跑出胶,以利于高分子量蛋白的分离. 电泳过程中易出现的问题: 电泳液过少：内槽超过短板，外槽约4CM深 蛋白条带弥散:样品可能在电泳前就已经弥散了,应加样后尽快电泳 笑纹效应(smile effect):指示剂前沿呈现两边向上的曲线形凝胶的不均匀冷却,中间部分冷却不好. “皱眉”现象(frown effect):指示剂前沿呈现两边向下的曲线形: 拖尾现象:样品溶解不佳. 蛋白条带融合在一起：液体过期或丙