6_分子生物学研究方法(下)2.ppt

6 分子生物学研究方法（下）——基因功能研究技术 6. 1 基因表达研究技术 6. 1. 1 基因表达系列分析技术（Serial Analysis of Gene Expression，SAGE） 是以DNA序列测定为基础分析全基因组表达模式的技术。任何长度超过9-10个碱基的核 苷酸片段都可能代表一种特异性的转录产物，因此，根据某个序列占总标签数的比例 可分析所对应基因的表达频率。 LongSAGE技术 标签来自转录物3’端一段21bp的序列，可以进行快速分析并与基因组序列数据相匹配。其原理与ShortSAGE方法类似，只是用了不同的IIS类标签酶（MmeI），并将程序做了相应修改。 6.1.2 RNA的选择性剪接技术 RNA的选择性剪接是指用不同的剪接方式从一个mRNA前体产生不同的mRNA剪接异构体的过程。可分为：平衡剪切、5’选择性剪切、3’选择性剪切、外显子遗漏型剪切及相互排斥性剪切。 6.1.3原位杂交技术 原位杂交(In Situ Hybridization，ISH)是用标记的核酸探针，经放射自显影或非放射检测体系，在组织、细胞、间期核及染色体上对核酸进行定位和相对定量研究的一种手段，分为 RNA原位杂交 染色体原位杂交。 RNA原位杂交：用放射性或非放射性（如地高辛、生物素等）标记的特异性探针与被固定的组织切片反应，若细胞中存在与探针互补的mRNA分子，两者杂交产生双链RNA，可通过放射性标记或经酶促免疫显色，对该基因的表达产物做出定性定量分析。 荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，FISH).首先对寡核苷酸探针做特殊的修饰和标记，然后用原位杂交法与靶染色体或DNA上特定的序列结合，再通过与荧光素分子相耦联的单克隆抗体来确定该DNA序列在染色体上的位置。 6.1.4基因定点突变(site-directedmutagenesis). 通过改变基因特定位点核苷酸序列来改变所编码的氨基酸序列，用于研究某个（些）氨基酸残基对蛋白质的结构、催化活性以及结合配体能力的影响，也可用于改造DNA调控元件特征序列、修饰表达载体、引入新的酶切位点等。 目前，主要采用两种PCR方法， 重叠延伸技术 大引物诱变法， 在基因序列中进行定点突变。 PCR介导的定点突变方法的优势 1.突变体回收率高 2.能用双链DNA作为模板，可在任何位点引入突变 3.可在同一试管中完成所有反应 4.快速简便 6.2基因敲除技术 6.2.1基本原理 经典遗传学（Forward genetics）是从一个突变体的表型出发，研究其基因型，进而找出该基因的编码序列。 现代遗传学（Reverse genetics，反向遗传学）首先从基因序列出发，推测其表现型，进而推导出该基因的功能。 基因敲除（gene knock-out）又称基因打靶，通过外源DNA与染色体DNA之间的同源重组，进行精确的定点修饰和基因改造，具有专一性强、染色体DNA可与目的片段共同稳定遗传等特点。 基因敲除分为 完全基因敲除：是指通过同源重组法完全 消除细胞或者动物个体中的靶基因活性 条件型基因敲除：（又称不完全基因敲 除），是指通过定位重组系统实现特 定时间和空间的基因敲除。 噬菌体的Cre/Loxp系统、Gin/Gix系统、酵母细胞的FLP/FRT系统和R/RS系统是现阶段常用的四种定位重组系统，尤以Cre/Loxp系统应用最为广泛。 由于基因转移的同源重组自然发生率极低，动物的重组概率约为10-2～10-5，植物的概率为10-4～10-5，即使采用双向选择法也很难保证一次就从众多细胞中筛选出真正发生了同源重组的胚胎干细胞，得用多种分子筛选技术验证所获得的确实是目的基因被敲除的细胞系。 ①构建条件型基因敲除打靶载体，将正向选择标记neo置于靶基因的内含子中，并在靶基因重要功能域两侧内含子中插入同向LoxP位点。 ②需要消除靶基因活性时，与带有Cre重组酶基因的ES细胞杂交，Cre可把两个LoxP位点间的DNA片段切除，导致靶基因失活。也可用Cre表达质粒转染中靶ES细胞，通过重组将两个LoxP位点间序列删除（包括neo基因）。 6.2.2高等动物基因敲除技术 真核生物基因敲除的技术路线主要包括构建重组基因载体，用电穿孔、显微注射等方法把重组DNA导入胚胎干细胞纯系中，使外源DNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组，将重组载体中的DNA序列整合到内源基因组中并得以表达。 显微注射命中率较高，技术难度相对大些。电穿孔法命中率比显微注射低，操作使用方便。 胚胎干细胞（ES细胞）分