6重组DNA导入受体细胞.ppt

基因工程 第六节 重组DNA导入受体细胞 第六节 重组DNA导入受体细胞 按 DNA片段连接重组的方法，目的基因与载体连接后成为重组 DNA 分子。而重组 DNA分子只有进入适宜的受体细胞后才能进行大量的扩增和有效的表达。目的基因能否有效地进入受体细胞，除了选用上述合适的克隆载体外，还取决于选用的受体细胞和转移方法。 一、受体细胞 二、重组DNA导入受体细胞的途径 一、受体细胞 1. 受体细胞的定义与选择原则 2. 受体细胞的类型 1. 受体细胞的定义与选择原则 （1）受体细胞 指能够摄取外源DNA（基因）并使其稳定遗传的细胞。 作为基因工程的受体细胞，从实验技术上讲是能摄取外源 DNA(基因)，并使其稳定维持的细胞；从实验目的上讲是有应用价值或理论研究价值的细胞。 原核生物细胞和真核生物细胞可作为受体细胞，但不是所有细胞都可以作为受体细胞。 在目的基因与载体连接成重组DNA分子以后，下面的重要工作主要是将其导入受体细胞进行扩增和筛选，获得大量的重组DNA分子，这就是外源基因的无性繁殖，即克隆(cloning)。 （2）受体细胞的选择原则 据所用载体体系及受体细胞的基因型进行选择； 重组体的转化或转染率高； 能够稳定遗传； 受体细胞基因型与载体所含的选择标记匹配； 易于筛选重组体； 外源基因可以高效表达和稳定遗传； 此外，安全性、导入方法、翻译及后加工机制和生产应用价值等。 2. 受体细胞的类型 （1）微生物表达系统（是较为理想的受体细胞） 优点： ①无纤维素组成的坚硬细胞壁，便于外源 DNA 进入； ②无核膜，外源DNA 与裸露的染色体 DNA 重组简单； ③基因组小，便于对引入的外源基因进行遗传分析； ④容易获得一致性的实验材料，培养简单，繁殖迅速，实验周期短，重复实验快。 2. 受体细胞的类型 （1）微生物表达系统 缺点：缺乏蛋白质的修饰作用，故微生物细胞不能直接表达真核生物基因，但可以通过对真核生物基因进行适当的修饰或采用cDNA克隆而加以改进。 2. 受体细胞的类型 （1）微生物表达系统 常用微生物表达系统： 大肠杆菌 枯草杆菌 蓝细菌 棒状杆菌和链霉菌 酵母菌 大肠杆菌 优势：全基因组测序共有4405个开放型阅读框架；克隆表达系统成熟完善，繁殖迅速、培养简单、遗传稳定，曾被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物，现已用来生产人胰岛素、生长素及干扰素等。 劣势：缺乏对真核生物蛋白质的复制、修饰后加工功能；内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白，含有种类繁多的内毒素。 枯草杆菌 亦称枯草芽孢杆菌。 优势： 具有胞外酶分泌调节基因，能将基因表达产物高效的分泌到培养基中，简化了加工提取工艺，所分泌的真核基因产物具有天然构象和生物活性；不产生内毒素，无致病性；具有芽孢形成能力，易于保存和培养，代谢易控制。 成功表达了β-干扰素、白细胞介素、乙肝病毒核心抗原及淀粉酶、高温脂肪酶等。 劣势：产物易被自身分泌的蛋白酶分解，而且重组体稳定性差。 蓝细菌 亦称蓝藻，与细菌亲缘关系密切。 优势：自养型，嫩能够进行光合作用释放氧气，培养简单易行，可能成为植物基因表达的宿主。 现已获得了高效表达的PHB等产物的蓝藻工程菌（用于生产可降解塑料），作为生物反应器，大量生产药物、燃料等具有应用价值的产品。 棒状杆菌和链霉菌 用于生产氨基酸和抗生素等产品。 酵母菌 是以芽殖或裂殖进行无性繁殖的单细胞真核生物。 优势：除了真核生物细胞共有的特性外，还具有以下优点：①基因结构相对比较简单，对其基因表达调控机制研究得比较清楚，便于基因工程操作；②培养简单，适于大规模发酵生产，成本低廉；③外源基因表达产物能分泌到培养基中，便于产物的提取和加工；④不产生毒素，是安全的受体细胞。 （2）植物表达系统 主要是利用农杆菌转染的方法将目的基因导入，多用于双子叶植物。 最突出的优点：体细胞的全能性，即一个分离的活细胞在合适的培养条件下，比较容易再分化成植株，这意味着一个获得外源基因的体细胞可以培养出能稳定遗传的植株或品系。 （2）植物表达系统 不足之处：植物细胞有纤维素参与组成的坚硬细胞壁，不利于摄取重组 DNA 分子。 克服方法：纤维素酶处理获得原生质体，采用农杆菌介导法或用基因枪、电激仪处理等方法，同样可使外源 DNA进入植物细胞。 （3）动物细胞表达系统 主要用于大规模的表达天然状态的复杂蛋白质或动物疫苗、动物品种遗传改良及人类基因的遗传治疗等。 昆虫细胞：能表达原核基因和哺乳动物基因，具有较强的分泌能力和修饰能力，但糖基化的寡糖链与人类糖蛋白的相差较大，多用于抗体生产。 哺乳动物细胞：具有很强的蛋白质修饰能力，基因产物分泌能力强，有很强的遗传稳定性和可重复性，但组培条件要求苛刻，易污染，成本高。 二、重组DNA导入受体细胞的途径 转化：tra