第二章流加发酵与高密度培养讲解.ppt

反应器 HCDC的生物反应器类型包括： 具有底物流加装置的通用式搅拌罐反应器 带有各种内置或外置细胞维持装置的搅拌罐反应器 膜透析反应器 气升式反应器 陶瓷膜摇瓶 透析反应器 反应器 HCDC问题的解决 HCDC遇到的主要问题有： 产物或代谢副产物的积累对生长的抑制 氧的限制 HCDC中培养基粘度不断增加，引起混合不充分 CO2和热量的高释放率 下面以大肠杆菌为例，来探讨如何解决HCDC中的问题。 大肠杆菌HCDC中乙酸的形成 乙酸是大肠杆菌流入中心代谢途径的碳超过生物合成的需要和产生能量超过细胞的容量时产生的。 高浓度的乙酸（如pH7，超过5gL-1）会降低HCDC的生长速率、生物量和可获得的最大细胞密度。 乙酸毒害作用的机理还未被阐明。很有可能是因为抑制DNA、RNA、蛋白质和脂肪的合成。 HCDC遇到的问题 控制比生长速率在产生乙酸的临界值以下 一般可通过控制限制性底物浓度控制比生长速率。 比生长速率临界值： 在复合和半合成培养基中，约为为0.2h-1和0.35h-1； 在合成培养基中，为0.14h-1。 HCDC遇到的问题 减少乙酸合成的方法 选择合适的培养基 例如，甘油比葡萄糖吸收进入细胞的速度要慢，可能会减少流入糖酵解途径的碳，这会极大的减少乙酸的合成。 HCDC遇到的问题 此外，加入某些氨基酸（如谷氨酸、甲硫氨酸），可减轻乙酸的毒害作用。 使用酸和碱调节pH而积累下来的盐会使乙酸的毒害作用加强。 大肠杆菌 葡萄糖 Pta Ack 乙酸 去往其它产物（乙醇、乙醛等） TCA循环中过剩的碳 乙酸代谢过程示意图 磷酸转移酶体系 修饰 截断 加强 代谢工程的方法减少乙酸合成 CoA 氧的限制 氧经常是高细胞密度培养的限制因素。 因为氧的溶解度很低。25℃、1大气压下，水中饱和溶解氧浓度为7mgL-1。 HCDC遇到的问题 提高溶氧的方法有： 提高通气速率和搅拌速度 富氧空气和纯氧 在加压环境下培养 混合的限制 HCDC的另一个物理限制。 发酵罐体积越大问题越明显。 靠近进料口部分的细胞暴露在高浓度营养物中。 而其它位置的细胞则处于饥饿状态。 HCDC遇到的问题 有必要研究发酵罐中的搅拌模型，找到改善搅拌的方法。 二氧化碳和放热的影响 HCDC中高细胞密度培养中的二氧化碳会影响细胞的生长。高CO2分压（0.3atm）会降低生长速率并刺激乙酸的生成。 放热也是高细胞密度培养的一个问题。 这些问题可通过降低细胞比生长速率而部分的解决。 热量的主要来源是搅拌产生的机械热和细胞代谢产生的热量。 HCDC遇到的问题 温度的影响 把培养温度从37℃降到26－30℃，会降低营养吸收和生长速度，因此会减少有毒副产物和代谢产生的热量。 降低温度也能减少细胞对氧的需求。 降低重组细胞温度也有可能减少包含体形式的蛋白质的产生。 以上这些优点说服了许多研究者使用低温，对大肠杆菌进行高细胞密度培养。 HCDC遇到的问题 流加控制策略 有两种主要的营养流加控制策略： 开环（无反馈）控制 闭环（反馈）控制 补料方式是高细胞密度培养取得成功的关键因素。 它不仅影响最大可获得细胞的浓度，而且影响细胞的产率。 产物形成会受各种补料策略的影响。 高细胞密度培养通常在营养（碳）限制的条件下进行。 条件 预设参数 开环（无反馈）控制 流加控制策略 DO 温度 pH 培养基 搅拌 压力 流加 控制 无反馈控制的流加策略 恒速流加——以预先决定的（恒定的）速率流加营养物质，比生长速率逐渐降低。 加速流加——以逐渐增加的速率流加营养物质。可补偿一些比生长速率的降低。 指数流加——以指数的速率流加营养物质。可得到恒定的比生长速率。 流加控制策略 条件 闭环（反馈）控制 即时DO 即时pH CER 细胞浓度 碳源浓度 反馈控制 流加控制策略 DO 温度 pH 培养基 搅拌 压力 流加 控制 间接反馈控制 即时DO——当DO降低时补加营养物质。 即时pH——主要碳源耗尽引起pH上升时补加营养物质。 二氧化碳释放率（CER）——CER基本正比于碳源的消耗速度。这一方法最为经常用于控制比生长速率。 细胞浓度——营养物质流加速率由细胞浓度决定。 反馈控制 流加控制策略 直接反馈控制 流加控制策略 底物浓度控制——营养物质流加速率直接由主要碳源的浓度控制 例如，使用一种在线葡萄糖分析仪控制发酵罐中的葡萄糖 。 结论 很多微生物都可通过前面提到的补料方式进行补料分批培养，生长到高密度。 现在，通过控制乙酸的浓度低于抑制水平，大肠杆菌可以很容易的获得大于100g（DCW）L-1的细胞干重。 控制比生长速率低于乙酸形成的临界值的指数流加方法是相当有用的。因为它简单且不需要任何特殊装置。 在线传感系统和精